Die hier vorgestellten Methoden ermöglichen die Quantifizierung von DNA-Läsionen, die durch oxidativen Stress induziert werden, und tragen zum Verständnis pathophysiologischer Mechanismen bei, die zielartig für die Prävention und Behandlung von Krankheiten sein können. Selektivität und Empfindlichkeit sind die Hauptvorteile. Selektivität ist ein wesentlicher Vorteil bei der Arbeit mit komplexen biologischen Proben.
HPLC gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie entwickelte sich als Goldstandard für diese Art der Quantifizierung mit biologischen Matrizen. Oxidativer Stress ist ein häufiges Ereignis für verschiedene pathophysiologische Prozesse. Erhöhte Etheno-Addukte wurden in Geweben oder Urin von Patienten mit entzündlichen Erkrankungen nachgewiesen.
Die DNA-Läsionen liefern auch Informationen über endogene Ereignisse, die durch die Exposition gegenüber Schadstoffen ausgelöst werden. Wenn die DNA-Läsionen erhöht werden, kann die Exposition auf dem Niveau sein, das das Risiko der Krebsentwicklung erhöht, zum Beispiel. Die Läsionen können in der DNA aus jedem zellulären System und alternativ in Urin, Plasma, Speichelkulturmedium mit Anpassungen in der Probenvorbereitung quantifiziert werden.
Verwenden Sie zunächst eine Kulturplatte, die auf Eis als Basis gelegt wird, um ein Stück Gewebe mit einem Skalpell zu schneiden. Wiegen Sie ein Gramm des Gewebes in jedem 50-Milliliter-Rohr für den sofortigen Gebrauch. Bewahren Sie das restliche Gewebe auf Trockeneis auf, bevor Sie es bei minus 80 Grad Celsius lagern.
In jede Röhre 10 Milliliter der kommerziellen Zelllyselösung mit 0,5 Millimolar Deferoxamin hinzufügen und auf Eis halten. Stellen Sie den Gewebehomogenisator auf eine niedrige Geschwindigkeit von etwa 60 bis 90 Umdrehungen pro Minute ein. Homogenisieren Sie die Gewebe auf Demeis für ein paar Minuten, bis die Lösung ohne Gewebefragmente ist.
Dann fügen Sie 150 Mikroliter Proteinase-K-Lösung zu jeder homogenisierten Probe hinzu. Schütteln Sie die Rohre durch Umkehrung, und halten Sie sie bei Raumtemperatur über Nacht. Am Morgen 40 Mikroliter Ribonuklease Eine Lösung hinzufügen, durch Inversion schütteln und die Rohre zwei Stunden bei Raumtemperatur halten.
Fügen Sie fünf Milliliter kommerzielle Protein-Fälllösung, Wirbel kräftig, und Zentrifuge bei 2 000 mal g, vier Grad Celsius, für 10 Minuten. Übertragen Sie die Überräube in 50-Milliliter-Behälter mit 10 Milliliter kaltem Isopropanol. Invertieren Sie die Röhren vorsichtig mehrmals bis zur Beobachtung der gefällten DNA.
Verwenden Sie eine Pasteur Pipette am Ende geschlossen, um die gefällte DNA zu sammeln. Übertragen Sie die gesammelte DNA in Tuben, die vier Milliliter 10-Millimolar Tris-Puffer und ein Millimolar-Deferoxamin bei pH-Wert sieben enthalten, um sich aufzulösen. Nachdem die DNA vollständig in den Röhrchen gelöst ist, fügen Sie vier Milliliter einer Chloroformlösung, die 4% Isoamylalkohol enthält, in jede Röhre ein.
Umkehren Sie die Rohre 10 Mal für die Homogenisierung, Zentrifuge bei 2.000 mal g, vier Grad Celsius, für 10 Minuten, und übertragen Sie die oberen Phasen auf neue Rohre. Wiederholen Sie die Wäsche der oberen Phase mit der Chloroformlösung zwei weitere Male. Dann fügen Sie acht Milliliter absolutes Ethanol und 0,4 Milliliter einer fünfmollaren Natriumchloridlösung hinzu, um die DNA auszufällen.
Wieder sammeln Sie die gefällte DNA und übertragen Sie sie auf drei Milliliter 70% Ethanol. Wiederholen Sie die Wäsche mit 70%Ethanol noch einmal. Entsorgen Sie die Ethanollösung mit Vorsicht und kehren Sie die Rohre um, die die gefällte DNA auf saugfähigem Papier enthalten, um überschüssige Lösung zu entfernen.
Nach der Herstellung von DNA-Hydrolyseproben mit 15N5 Isotopenstandard von 1, N6-Etheno-Deoxyadenosin und 15N5-Isotopenstandard von 1, N2-Etheno-Deoxyguanosin gemäß Manuskript, übertragen Sie 10 Mikroliter jeder Probe in Tuben zur Quantifizierung normaler Desoxynukleoside durch HPLC-UV. Unterwerfen Sie das Restvolumen der Festphasenextraktion. Um HPLC durchzuführen, wird zunächst eine C18-Säule an einer C18 SecurityGuard-Patrone mit einem Gradienten von 0,1% Ameisensäure und Methanol befestigt.
Richten Sie das Gradientenprogramm ein, um von null bis 25 Minuten mit null bis 18 % Methanol, von 25 bis 27 Minuten mit 18 bis 0% Methanol, dann von 27 bis 37 Minuten mit 0% Methanol bei einer Durchflussrate von einem Milliliter pro Minute und 30 Grad Celsius zu laufen. Danach wird für jede Probe ein Volumen zwischen zwei und sechs Mikrolitern injiziert, das für die normale Quantifizierung von Desoxynukleosiden reserviert ist. Stellen Sie den DAD-Detektor auf 260 Nanometer für die Integration der Desoxyguanosin- und Desoxyadenosinspitzen.
Um die Festphasenextraktion für Analysen von 1, N6-Etheno-Deoxyadenosin und 1, N2-Etheno-Deoxyguanosin durchzuführen, laden Sie die Patronen zunächst mit einer Reihe von Lösungen mit einem Volumen von einem Milliliter. 100% Methanol, entionisiertes Wasser, hydrolysierte DNA-Probe, entionisiertes Wasser, 10%Methanol, 15%Methanol und schließlich 100% Methanol zur Sammlung hinzufügen. Gehen Sie dann nach dem Manuskript vor.
Nach der Herstellung von DNA-Hydrolyseproben 15N5 Isotop-Standard von 8-Oxo-Deoxyguanosin, übertragen Sie 80 Mikroliter jeder Probe in Fläschchen zur Analyse im HPLC-ESI-MS/MS-System. Reservieren Sie die restlichen 20 Mikroliter für die Quantifizierung von Desoxyguanosin auf HPLC-UV, wie zuvor getan. Zur Analyse von 8-Oxo-Deoxyguanosin auf HPLC-ESI-MS/MS wird die C18-Säule A mit einer C18 SecurityGuard-Patrone mit einem Gradienten von Lösungsmittel A und B bei einer Durchflussrate von 150 Mikrolitern pro Minute und 25 Grad Celsius gekoppelt.
Führen Sie die binäre Pumpe mit null bis 15 % des Lösungsmittels B in den ersten 25 Minuten, 15 bis 80 % des Lösungsmittels B von 25 bis 28 Minuten, 80 % des Lösungsmittels B von 28 bis 31 Minuten, 80 bis 0 % des Lösungsmittels B von 31 bis 33 Minuten und 0 % des Lösungsmittels B von 33 bis 46 Minuten. Richten Sie die ersten 16 Minuten der Spalte A eluent auf Abfall. Zustandssäule B durch die isotratische Pumpe mit einer Lösung von 15%Methanol in Wasser, das 0,1%Ameisensäure bei einer Durchflussrate von 150 Mikrolitern pro Minute enthält.
Überprüfen Sie nach sechs Minuten das Chromatogramm, um sicherzustellen, dass die 8-Oxo-Deoxyguanosin-Standardelutes aus Der Spalte A. Während des Intervalls von 16 bis 32 Minuten das Ventil auf die Position schalten, die eine Verbindung zwischen Spalte A und Spalte B ermöglicht. Schließen Sie das Ventil bei 32 Minuten, um 8-Oxo-Deoxyguanosin aus der zweiten Kolonne zu elute und erhalten Sie eine scharfe chromatographische Spitze. Zur Analyse von 1, N6-Etheno-Deoxyadenosin und 1, N2-Etheno-Deoxyguanosin, eine C18-Säule gekoppelt mit einer C18 SecurityGuard-Patrone mit einem Gradienten von Lösungsmittel A und B bei einer Durchflussrate von 130 Mikroliter pro Minute und 25 Grad Celsius. Führen Sie die binäre Pumpe mit 0% Lösemittel B für die ersten 10 Minuten, null bis 20% des Lösungsmittels B für 10 bis 39 Minuten, 20 bis 75% des Lösungsmittels B von 39 bis 41 Minuten, 75% des Lösungsmittels B von 41 bis 46 Minuten, 75 bis 0% des Lösungsmittels B von 46 bis 47 Minuten und 0% des Lösungsmittels B von 47 bis 60 Minuten.
Verwenden Sie das Schaltventil, um die ersten 35 Minuten des Eluents auf Abfall und den Anteil von 35 bis 42 Minuten an die ESI-Quelle zu leiten. Stellen Sie sicher, dass die Adduktorenstandards aus der Spalte im festgelegten Intervall entfernt sind. Integrieren Sie die Spitzen des 8-Oxo-Deoxyguanosin 15N5-Isotopenstandards von 8-Oxo-Deoxyguanosin, 1, N6-Etheno-Deoxyadenosin, 15N5 Isotop-Standard von 1, N6-Etheno-Deoxyadenosin, 1, N2-Etheno-Deoxyguanosin und 15N5 Isotop-Standard von 1, N2-Etheno-Deoxyguanosin aus den HPLC-ESI-MS/MS-Analysen.
Berechnen Sie die Flächenverhältnisse für die Kalibrierkurven und die Proben. Legen Sie die Kalibrierkurven fest, und berechnen Sie die Arten von Läsionen in jeder injizierten Probe. Integrieren Sie die Spitzen von Desoxyguanosin und Desoxyadenosin aus den HPLC-UV-Analysen.
Verwenden Sie die Bereiche, um die Kalibrierkurven zu bestimmen, und berechnen Sie die Mengen an Desoxyguanosin und Desoxyadenosin bei Tieren in jeder injizierten Probe. Berechnen Sie die Molfraktionen für 8-Oxo-Deoxyguanosin über Desoxyguanosin, 1, N6-Etheno-Deoxyadenosin über Deoxyadenosin und 1, N2-Etheno-Deoxyguanosin über Desoxyguanosin, die die Anzahl der Läsionen pro eine Million normaler Desoxyguanosin oder Deoxyadenosin ergeben. Ein repräsentatives Chromatogramm der von HPLC-UV erhaltenen gereinigten DNA zeigt das Vorhandensein der vier normalen Desoxynukleoside, frei von den RNA-Ribonukleosiden, die die DNA-Reinheit demonstrieren.
Repräsentative Chromatogramme von HPLC-ESI-MS/MS aus 8-Oxo-Deoxyguanosin, 1, N6-Etheno-Deoxyadenosin und 1, N2-Etheno-Deoxyguanosin in Mäusegewebe-DNA-Proben werden gezeigt. Das mit UV-Detektion erhaltene Chromatogramm zeigt die vier normalen Desoxynukleosideen, die von der ersten Kolonne bis etwa 10 Minuten eluieren, mit einer guten Trennung von 8-Oxo-Deoxyguanosin, wodurch unerwünschte Interferenzen vermieden werden. Für exakte Quantifizierungen ist es wichtig, in den Kalibrierkurven und Proben immer die gleichen Mengen an internen Standards im Injektionsvolumen zu haben.
Die hier vorgestellten Methoden können für die Quantifizierung anderer modifizierter Desoxynukleoside angepasst werden. Die Erweiterung des Bandes modifizierter Desoxynukleoside ermöglicht ein besseres Verständnis der zugrunde liegenden pathophysiologischen Mechanismen. Wir können die Rolle oxidativer Schäden in verschiedenen Situationen wie der Exposition gegenüber Xenobiotika, Diabetes und bösartigen Zelltransformationen untersuchen und so die Entwicklung von Präventions- und Behandlungsstrategien unterstützen.
