Представленные здесь методы позволяют количественно оценить поражения ДНК, вызванные окислительным стрессом, способствуя пониманию патофизиологических механизмов, которые могут быть направлены на профилактику и лечение заболеваний. Избирательность и чувствительность являются основными преимуществами. Избирательность является существенным преимуществом при работе со сложными биологическими образцами.
HPLC в сочетании с тандемом масс-спектрометрии развивалась как золотой стандарт для этого типа количественной оценки с биологическими матрицами. Окислительный стресс является общим событием для различных патофизиологических процессов. Повышенный уровень этино аддуктов были обнаружены в тканях или моче пациентов с воспалительными заболеваниями.
Поражения ДНК также предоставляют информацию об эндогенных событиях, вызванных воздействием загрязняющих веществ. Если поражения ДНК увеличиваются, воздействие может быть на уровне, который увеличивает риск развития рака, например. Поражения могут быть количественно в ДНК из любой клеточной системы и в качестве альтернативы в моче, плазме, слюне культуры среды с адаптацией в подготовке образца.
Для начала используйте культурную тарелку, помещенную на лед в качестве основы, чтобы вырезать кусок ткани скальпелем. Взвесить один грамм ткани в каждой 50-миллилитровой крышкой трубки для немедленного использования. Держите оставшиеся ткани на сухом льду перед хранением при температуре минус 80 градусов по Цельсию.
К каждой трубке добавьте 10 миллилитров раствора коммерческого клеточного лиза, содержащего 0,5-миллимолярный дефероксамин, и держите на льду. Установите гомогенизатор ткани на низкой скорости, около 60 до 90 об/мин. Гомогенизировать ткани на льду в течение нескольких минут, пока раствор без фрагментов тканей.
Затем добавьте 150 микролитров раствора протеиназы K в каждый гомогенизированный образец. Встряхните трубки инверсией и держите их при комнатной температуре на ночь. Утром добавьте 40 микролитров раствора рибонуклеазы А, встряхните инверсией и держите трубки при комнатной температуре в течение двух часов.
Добавьте пять миллилитров раствора коммерческих белковых осадков, вихрь энергично, и центрифуга в 2000 раз г, четыре градуса по Цельсию, в течение 10 минут. Перенесите супернатанты на 50-миллилитровые трубки с 10 миллилитров холодного изопропанола. Переверните трубки осторожно несколько раз до наблюдения осажденной ДНК.
Используйте трубку Pasteur закрытую в конце для того чтобы собрать осаждаемую дна. Передача собранной ДНК в трубки, содержащие четыре миллилитров 10-миллимолярный буфер Tris и один миллимолярный удополномочных препаратов при рН семь для растворения. После того, как ДНК полностью растворяется в трубках, добавьте четыре миллилитра хлороформного раствора, содержащего 4%изоамиловый спирт в каждую трубку.
Переверните трубки 10 раз для гомогенизации, центрифугу при 2000 раз г, четыре градуса по Цельсию, в течение 10 минут, и перенесите верхние фазы в новые трубы. Повторите промывку верхней фазы с раствором хлороформа еще два раза. Затем добавьте восемь миллилитров абсолютного этанола и 0,4 миллилитров пятимолярного раствора хлорида натрия для осаждения ДНК.
Опять же, собирать осаждаемую ДНК, и передать его в три миллилитров 70% этанола. Повторите мыть с 70%этанол еще раз. Отбросьте раствор этанола с осторожностью, и инвертировать трубки, содержащие осаждаемую ДНК на абсорбативной бумаге, чтобы удалить избыток раствора.
После подготовки образцов гидролиза ДНК с изотопным стандартом 15N5 1, N6-этино-деоксиаденозин и 15N5 изотопный стандарт 1, N2-этино-деоксигуанозин в соответствии с рукописью, передача 10 микролитров каждого образца в трубки для количественной оценки нормальных дезоксинуэзидов HPLC-UV. Подвергаем остаточный объем твердой фазе извлечения. Для выполнения HPLC, первый elute C18 колонке прилагается к картриджу C18 SecurityGuard с градиентом 0,1% formic кислоты и метанола.
Настройка градиентной программы для запуска от нуля до 25 минут с нулем до 18%метанола, от 25 до 27 минут с 18 до 0%метанол, затем от 27 до 37 минут с 0%метанол при скорости потока один миллилитр в минуту и 30 градусов по Цельсию. После этого ввимит объем от двух до шести микролитров для каждого образца, зарезервированного для нормальной количественной оценки деоксинуклеозидов. Установите детектор DAD на 260 нанометров для интеграции пиков деоксигуанозина и деоксяденозина.
Для выполнения твердой фазы экстракции для анализа 1, N6-этино-деоксяденозина и 1, N2-этино-дезигуанозина, сначала загрузите картриджи серией растворов объемом в один миллилитр. Добавьте 100% метанол, деионизированную воду, гидролизованный образец ДНК, деионизированную воду, 10%метанол, 15% метанол и, наконец, 100% метанол для сбора. Затем, продолжайте в соответствии с рукописью.
После подготовки образцов гидролиза ДНК 15N5 изотопного стандарта 8-оксо-дезигуанозина, перенесите 80 микролитров каждого образца во флаконы для анализа в системе HPLC-ESI-MS/MS. Зарезервировать оставшиеся 20 микролитров для количественной оценки деоксигуанозина на HPLC-UV, как это было сделано ранее. Для анализа 8-oxo-deoxyguanosine на HPLC-ESI-MS/MS, elute C18 колонка A в сочетании с картриджем C18 SecurityGuard с градиентом растворителя A и B со скоростью потока 150 микролитров в минуту и 25 градусов по Цельсию.
Запустите бинарный насос с нулем до 15% растворителя B в течение первых 25 минут, от 15 до 80% растворителя B от 25 до 28 минут, 80% растворителя B от 28 до 31 минут, от 80 до 0% растворителя B от 31 до 33 минут, и 0% растворителя B от 33 до 46 минут. Навемите первые 16 минут колонки A eluent на отходы. Состояние колонки B от изократического насоса с раствором 15%метанола в воде, содержащей 0,1%-ю микроматическую кислоту при скорости потока 150 микролитров в минуту.
Через шесть минут проверьте хроматограмму, чтобы обеспечить 8-oxo-deoxyguanosine стандартные элюты из столбца A.During интервала от 16 до 32 минут, переключите клапан на положение, позволяющее соединение между колонкой А и колонкой B.Close клапан на 32 минуты, чтобы elute 8-oxo-deoxyguanosine из второй колонки и получить резкий хроматографический пик. Для анализа 1, N6-etheno-deoxyadenosine и 1, N2-etheno-deoxyguanosine, elute колонка C18 соединенная к патрону C18 SecurityGuard с градиентом растворителя a и b на тарифе потока 130 микролитров в минуту и 25 градусов Celsius. Запустите бинарный насос с 0% растворителя B в течение первых 10 минут, от нуля до 20% растворителя B в течение 10 до 39 минут, от 20 до 75% растворителя B от 39 до 41 минут, 75% растворителя B от 41 до 46 минут, от 75 до 0% растворителя B от 46 до 47 минут, и 0% растворителя B от 47 до 60 минут.
Используйте клапан переключения, чтобы направить первые 35 минут элюента на отходы и от 35 до 42 минут фракции к источнику ESI. Убедитесь, что стандарты аддука утеха от столбца в установленной интервале. Интегрируйте пики 8-оксо-дезигуанозина 15N5 изотопного стандарта 8-оксо-дезигуанозина, 1, N6-этино-деоксиаденозин, 15N5 изотопный стандарт 1, N6-этино-деоксиаденозин, 1, N2-этино-дезигуанозин, и 15N5 изотопный стандарт 1, N2-этино-deoxyguanosine от HPLC-ESI-MS/MS анализов.
Рассчитайте соотношения площади для кривых калибровки и образцов. Установите кривые калибровки и вычислите количество повреждений в каждом инъекционной выборке. Интегрируйте пики дезоксигуанозина и деоксиаденозина из анализа HPLC-UV.
Используйте области для установления кривых калибровки, и рассчитать количество дезоксигуанозина и дезоксяденозина у животных в каждом введенном образце. Рассчитайте молярные фракции для 8-oxo-deoxyguanosine над дезоксигуанозином, 1, N6-этино-деоксиаденозин над дезоксаденозином, и 1, N2-этино-деоксигуанозин над дезоксигуанозином, которые дают количество поражений на один миллион нормальных дезоксигуано. Репрезентативная хроматограмма очищенной ДНК, полученная HPLC-UV, показывает наличие четырех нормальных деоксинуклеозидов, свободных от РНК рибонуклеозидов, демонстрирующих чистоту ДНК.
Показаны репрезентативные хроматограммы из HPLC-ESI-MS/MS 8-оксо-дезигуанозина, 1, N6-этино-деоксиаденозина и 1, N2-этино-дезигуанозин в образцах ДНК тканей мышей. Хроматограмма, полученная с помощью УФ-обнаружения, показывает, что четыре нормальных дезоксинулозида вытугнули из первой колонки примерно до 10 минут, с хорошим отделением от 8-оксо-дезигуаносина, устраняя нежелательные помехи. Важно помнить о точных количественных данных, чтобы всегда иметь одинаковое количество внутренних стандартов в объеме впрыска в кривых калибровки и образцов.
Представленные здесь методы могут быть адаптированы для количественной оценки других модифицированных дезоксинуклеозидов. Расширение полосы модифицированных деоксинуклеозидов позволяет лучше понять лежащие в основе патофизиологические механизмы. Мы можем исследовать роль окислительного повреждения в различных ситуациях, таких как воздействие ксенобиотики, диабет, и злокачественные преобразования клеток, тем самым помогая развитию превентивных и лечебных стратегий.
