Les méthodes présentées ici permettent la quantification des lésions d’ADN induites par le stress oxydatif, contribuant à la compréhension des mécanismes pathophysiologiques qui peuvent être la cible pour la prévention et le traitement des maladies. La sélectivité et la sensibilité sont les principaux avantages. La sélectivité est un avantage essentiel lorsque vous travaillez avec des échantillons biologiques complexes.
Hplc couplé à la spectrométrie de masse tandem a évolué comme l’étalon-or pour ce type de quantification avec des matrices biologiques. Le stress oxydatif est un événement commun à différents processus pathophysiologiques. Des niveaux accrus d’adducteurs d’etheno ont été détectés dans les tissus ou l’urine des patients présentant des maladies inflammatoires.
Les lésions d’ADN fournissent également l’information sur des événements endogènes déclenchés par l’exposition aux polluants. Si les lésions d’ADN sont augmentées, l’exposition peut être au niveau qui augmente le risque de développement du cancer, par exemple. Les lésions peuvent être quantifiées dans l’ADN de n’importe quel système cellulaire et alternativement dans l’urine, le plasma, le milieu de culture de salive avec des adaptations dans la préparation d’échantillon.
Pour commencer, utilisez une plaque de culture placée sur la glace comme base pour couper un morceau de tissu avec un scalpel. Pesez un gramme du tissu dans chaque tube plafonné de 50 millilitres pour une utilisation immédiate. Gardez le reste des tissus sur de la glace sèche avant de le stocker à moins 80 degrés Celsius.
À chaque tube, ajouter 10 millilitres de la solution de lyse cellulaire commerciale contenant de la deferoxamine de 0,5 millimolaire et garder sur la glace. Réglez l’homogénéiseur tissulaire à basse vitesse, autour de 60 à 90 rpm. Homogénéiser les tissus sur la glace pendant quelques minutes jusqu’à ce que la solution soit sans fragments de tissu.
Ajouter ensuite 150 microlitres de solution proteinase K à chaque échantillon homogénéisé. Secouez les tubes par inversion et gardez-les à température ambiante pendant la nuit. Le matin, ajouter 40 microlitres de ribonuclease Solution A, secouer par inversion, et garder les tubes à température ambiante pendant deux heures.
Ajouter cinq millilitres de solution commerciale de précipitation protéique, vortex vigoureusement, et centrifugeuse à 2000 fois g, quatre degrés Celsius, pendant 10 minutes. Transférer les supernatants dans des tubes plafonnés de 50 millilitres contenant 10 millilitres d’isopropanol froid. Inverser délicatement les tubes plusieurs fois jusqu’à l’observation de l’ADN précipité.
Utilisez une pipette Pasteur fermée à la fin pour recueillir l’ADN précipité. Transférer l’ADN recueilli dans des tubes contenant quatre millilitres de tampon Tris de 10 milli molaires et un millimolaire deferoxamine au pH sept pour dissoudre. Après la dissolution complète de l’ADN dans les tubes, ajouter quatre millilitres d’une solution chloroforme contenant 4% d’alcool d’isoamyle à chaque tube.
Inverser les tubes 10 fois pour l’homogénéisation, centrifugeuse à 2000 fois g, quatre degrés Celsius, pendant 10 minutes, et transférer les phases supérieures vers de nouveaux tubes. Répétez le lavage de la phase supérieure avec la solution chloroforme deux fois de plus. Ajoutez ensuite huit millilitres d’éthanol absolu et 0,4 millilitres d’une solution de chlorure de sodium cinq molaires pour précipiter l’ADN.
Encore une fois, recueillir l’ADN précipité, et le transférer à trois millilitres de 70% d’éthanol. Répétez le lavage avec 70% d’éthanol une fois de plus. Jetez la solution d’éthanol avec prudence et inversez les tubes contenant l’ADN précipité sur du papier absorbant pour éliminer l’excès de solution.
Après avoir préparé des échantillons d’hydrolyse d’ADN avec la norme isotopique 15N5 de 1, N6-etheno-deoxyadenosine et 15N5 norme isotopique de 1, N2-etheno-deoxyguanosine selon le manuscrit, transférer 10 microlitres de chaque échantillon dans des tubes pour la quantification des désoxynucléosides normaux par HPLC-UV. Soumettre le volume résiduel à l’extraction en phase solide. Pour effectuer HPLC, élisez d’abord une colonne C18 attachée à une cartouche C18 SecurityGuard avec un gradient de 0,1% d’acide formic et de méthanol.
Configurer le programme de gradient pour fonctionner de zéro à 25 minutes avec zéro à 18% de méthanol, de 25 à 27 minutes avec 18 à 0% de méthanol, puis de 27 à 37 minutes avec 0% de méthanol à un débit d’un millilitre par minute et 30 degrés Celsius. Par la suite, injecter un volume entre deux et six microlitres pour chaque échantillon réservé à la quantification normale des désoxynucléosides. Réglez le détecteur DAD à 260 nanomètres pour l’intégration des pics de désoxyguanosine et de désoxyadenosine.
Pour effectuer l’extraction en phase solide pour les analyses de 1, N6-etheno-deoxyadenosine et 1, N2-etheno-deoxyguanosine, chargez d’abord les cartouches avec une série de solutions à un volume d’un millilitre. Ajouter 100% de méthanol, d’eau déionisée, d’échantillon d’ADN hydrolysé, d’eau déionisée, 10% de méthanol, 15% de méthanol, et enfin 100% de méthanol pour la collecte. Ensuite, procédez selon le manuscrit.
Après avoir préparé des échantillons d’hydrolyse d’ADN 15N5 norme isotopique de 8-oxo-deoxyguanosine, transférer 80 microlitres de chaque échantillon dans des flacons pour analyse dans le système HPLC-ESI-MS/MS. Réservez les 20 microlitres restants pour la quantification de la désoxyguanosine sur HPLC-UV, comme cela a été fait précédemment. Pour l’analyse de la 8-oxo-deoxyguanosine sur HPLC-ESI-MS/MS, étiez la colonne C18 A couplée à une cartouche C18 SecurityGuard avec un gradient de solvant A et B à un débit de 150 microlitres par minute et 25 degrés Celsius.
Faire fonctionner la pompe binaire avec zéro à 15% du solvant B pendant les 25 premières minutes, 15 à 80% du solvant B de 25 à 28 minutes, 80% du solvant B de 28 à 31 minutes, 80 à 0% du solvant B de 31 à 33 minutes, et 0% du solvant B de 33 à 46 minutes. Dirigez les 16 premières minutes de la colonne A eluent à gaspiller. Condition colonne B par la pompe isocratique avec une solution de 15% de méthanol dans l’eau contenant 0,1% d’acide formique à un débit de 150 microlitres par minute.
Après six minutes, vérifiez le chromatogramme pour vous assurer que la norme de 8 oxo-deoxyguanosine s’échappe de la colonne A.Pendant l’intervalle de 16 à 32 minutes, passez la valve à la position permettant la connexion entre la colonne A et la colonne B.Fermez la valve à 32 minutes pour épuuter la 8-oxo-désoxyguanosine de la deuxième colonne et obtenir un pic chromatographique aigu. Pour l’analyse de 1, N6-etheno-deoxyadenosine et 1, N2-etheno-deoxyguanosine, elute une colonne C18 couplée à une cartouche C18 SecurityGuard avec un gradient de solvant A et B à un débit de 130 microlitres par minute et 25 degrés Celsius. Exécutez la pompe binaire avec 0% du solvant B pendant les 10 premières minutes, zéro à 20 % du solvant B pendant 10 à 39 minutes, 20 à 75 % du solvant B de 39 à 41 minutes, 75 % du solvant B de 41 à 46 minutes, 75 à 0 % du solvant B de 46 à 47 minutes et 0 % du solvant B de 47 à 60 minutes.
Utilisez la vanne de commutation pour diriger les 35 premières minutes d’étiente à gaspiller et la fraction de 35 à 42 minutes vers la source ESI. Assurez-vous que les normes d’adducteur s’échappent de la colonne dans l’intervalle défini. Intégrer les pics de 8-oxo-deoxyguanosine 15N5 norme isotopique de 8-oxo-deoxyguanosine, 1, N6-etheno-deoxyadenosine, norme isotopique 15N5 de 1, N6-etheno-deoxyadenosine, 1, N2-etheno-deoxyguanosine, et 15N5 norme isotopique de 1, N2-etheno-deoxyguanosine des analyses HPLC-ESI-MS/MS.
Calculer les ratios de surface pour les courbes d’étalonnage et les échantillons. Établissez les courbes d’étalonnage et calculez les quantités de lésions dans chaque échantillon injecté. Intégrer les pics de désoxyguanosine et de désoxyadenosine des analyses HPLC-UV.
Utilisez les zones pour établir les courbes d’étalonnage et calculer les quantités de désoxyguanosine et de désoxyadenosine chez les animaux de chaque échantillon injecté. Calculer les fractions molaire pour 8-oxo-deoxyguanosine sur la désoxyguanosine, 1, N6-etheno-deoxyadenosine sur la désoxyadenosine, et 1, N2-etheno-deoxyguanosine sur la désoxyguanosine, qui donnent le nombre de lésions par million de désoxyguanosine normale ou deoxyadenosine. Un chromatogramme représentatif de l’ADN purifié obtenu par HPLC-UV montre la présence des quatre désoxynucléosides normaux, exempts des ribonucleosides d’ARN, démontrant la pureté d’ADN.
Des chromatogrammes représentatifs de HPLC-ESI-MS/MS de 8-oxo-deoxyguanosine, 1, N6-etheno-deoxyadenosine, et 1, N2-etheno-deoxyguanosine dans des échantillons d’ADN de tissu de souris sont montrés. Le chromatogramme obtenu avec détection UV montre les quatre désoxynucléosides normaux s’échappant de la première colonne jusqu’à environ 10 minutes, avec une bonne séparation de 8-oxo-deoxyguanosine, éliminant les interférences non désirées. Une chose importante à retenir pour les quantifications exactes est d’avoir toujours les mêmes quantités de normes internes dans le volume d’injection dans les courbes d’étalonnage et les échantillons.
Les méthodes présentées ici peuvent être adaptées pour la quantification d’autres désoxynucléosides modifiés. L’expansion de la bande de désoxynucléosides modifiés permet une meilleure compréhension des mécanismes pathophysiologiques sous-jacents. Nous pouvons étudier le rôle des dommages oxydants dans différentes situations telles que l’exposition aux xénobiotiques, le diabète, et la transformation maligne de cellules, aidant ainsi le développement des stratégies préventives et de traitement.
