ここで提示される方法は、酸化ストレスによって誘導されるDNA病変の定量化を可能にし、疾患の予防および治療の標的となり得る病態生理学的メカニズムの理解に寄与する。選択性と感度が主な利点です。選択性は、複雑な生物学的サンプルを扱う場合に不可欠な利点です。
HPLCは、この種の生物学的マトリックスを用いた定量のゴールドスタンダードとして、タンデム質量分析法に結合して進化しました。酸化ストレスは、異なる病態生理学的プロセスに共通する事象である。炎症性疾患患者の組織または尿中に、エテノ内転差の増加レベルが検出された。
DNA病変はまた、汚染物質への暴露によって引き起こされる内因性事象に関する情報を提供する。DNA病変が増加した場合、例えば、暴露は癌発症のリスクを高めるレベルであってもよい。病変は、任意の細胞系からのDNAで定量することができ、代わりにサンプル調製における適応を伴う尿、血漿、唾液培養培地で。
まず、氷の上に置かれた培養プレートをベースにして、メスで組織の一部を切断します。即時使用のために各50ミリリットルのキャップチューブの組織の1グラムを量る。残りの組織をドライアイスに入れ、マイナス80度で保存してください。
各チューブに、0.5ミリモルのデフェオキサミンを含む市販の細胞溶解溶液を10ミリリットル加え、氷の上に置きます。組織ホモジナイザーを60~90rpm前後の低速に設定します。溶液が組織断片がなくなるまで、氷上の組織を数分間均質化する。
次に、150マイクロリットルのプロテイナーゼK溶液を各均質化サンプルに加えます。チューブを反転して振り、一晩室温に保ちます。朝、40マイクロリットルのリボヌクレアーゼA溶液を加え、反転して振り、チューブを室温で2時間保ちます。
5ミリリットルの市販タンパク質沈殿液を、渦を激しく加え、遠心分離機を2,000倍、摂氏4度で10分間加えます。冷たいイソプロパノールの10ミリリットルを含む50ミリリットルのキャップチューブに上清を移します。沈殿したDNAを観察するまで、チューブを数回やさしく反転します。
最後に閉じたパスツールピペットを使用して、沈殿したDNAを収集します。採取したDNAを、pH 7で4ミリリットルの10ミリモルトリスバッファーと1ミリモルデフェポキサミンを含むチューブに移して溶解する。DNAがチューブに完全に溶解した後、4%イソアミルアルコールを含むクロロホルム溶液の4ミリリットルを各チューブに加える。
チューブを均質化のために10回反転し、遠心分離機を2,000回g、摂氏4度で10分間反転し、上相を新しいチューブに移します。クロロホルム溶液で上相の洗浄を2回繰り返します。その後、8ミリリットルの絶対エタノールと0.4ミリリットルの5モル塩化ナトリウム溶液を加え、DNAを沈殿させます。
再度、沈殿したDNAを回収し、70%エタノールの3ミリリットルに移す。70%エタノールで洗浄をもう一度繰り返します。エタノール溶液を注意して捨て、吸収性紙に沈殿したDNAを含むチューブを反転して余分な溶液を除去する。
15N5同位体規格1のDNA加水分解サンプルを調製した後、N6-エテノ-デオキシアデノシンおよび15N5同位体標準1、N2-エテノ-デオキシグアノシンを原稿に従い、各サンプルの10マイクロリットルをチューブに移し、HPLC-UVによって正常なデオキシヌロシドを定量化する。残存体積を固相抽出対象とします。HPLCを実行するには、最初に0.1%ギ酸およびメタノールの勾配を有するC18 SecurityGuardカートリッジに取り付けられたC18カラムを溶出する。
0 ~25分から25分まで、メタノール18~0%で25~27分、27分から37分まで0%メタノール(1分あたり1ミリリットル、摂氏30度)で0%メタノールを使用して、勾配プログラムを設定します。その後、通常のデオキシヌクレオシド定量のために予約された各サンプルに対して2〜6マイクロリットルの間の体積を注入する。デオキシグアノシンとデオキシアデノシンのピークの統合のために260ナノメートルにDAD検出器を設定します。
1、N6-エテノ-デオキシアデノシンおよび1、N2-エテノ-デオキシグアノシンの分析のための固相抽出を行うために、最初に1ミリリットルの体積で一連の溶液でカートリッジをロードする。100%メタノール、脱イオン水、加水分解されたDNAサンプル、脱イオン水、10%メタノール、15%メタノール、および最後に100%メタノールを回収する。その後、原稿に従って進めます。
8-オキソオコ-デオキシグアノシンのDNA加水分解サンプル15N5同位体規格を調製した後、HPLC-ESI-MS/MSシステムで分析するために、各サンプルの80マイクロリットルをバイアルに移します。以前に行われたように、HPLC-UV上のデオキシグアノシンの定量のために残りの20マイクロリットルを予約してください。HPLC-ESI-MS/MS上の8-oxo-deoxyguanineの分析のために、C18カラムAを溶媒AとBの勾配を伴うC18 SecurityGuardカートリッジに、毎分150マイクロリットル、摂氏25度の流量で溶出します。
最初の25分間は溶媒Bの0~15%、溶媒Bの15~80%を25~28分、溶媒Bの80%を28分から31分、溶媒Bの80~0%を31分から33分、溶媒Bを0%33~46分で実行します。列Aの最初の16分を廃棄物に向けます。条件列Bは、1分あたり150マイクロリットルの流量で0.1%のギ酸を含む水中に15%メタノールの溶液を有するイソクラティックポンプによる。
6分後、クロマトグラムをチェックして、列A.16〜32分間隔で8-オキソ・デオキシグアノシン標準エルトを確認し、カラムAとB.列B.32分でバルブを閉じて2列目から8-オキソ・デオキシグアノシンを溶出させて、鋭いクロマグラフィーピークを得る。1、N6-エテノデオキシアデノシンおよび1、N2-エテノ-デオキシグアノシンの分析のために、C18カラムを溶媒AとBの勾配を持つC18 SecurityGuardカートリッジに、毎分130マイクロリットル、摂氏25度の流量で結びつきます。最初の10分間は溶媒Bの0%、10~39分間は溶媒Bの0~20%、溶媒Bの20~75%は39~41分、溶媒Bの75%は41分から46分、溶媒Bは46分から47分、Bは47分から47分まで0%の溶媒で、溶媒は0%を実行します。
切り替えバルブを使用して溶出液の最初の35分を廃棄物に、35〜42分の分数をESIソースに向けます。設定された間隔で、縦棒の基準が列から離れないようにしてください。8-オキソ-デオキシグアノシンのピークを統合します 15N5 8-オキソ-デオキシグアノシンの同位体標準, 1、N6-エテノ-デオキシアデノシン、15N5同位体標準1、N6-エテノデオキシアデノシン、1、N2-エテノデオキシグアノシン、および15N5同位体標準1、N2-エテノデオキシグアノシンからH-ESI-MS分析。
キャリブレーションカーブとサンプルの面積比を計算します。キャリブレーション曲線を確立し、注入された各サンプルの病変量を計算します。HPLC-UV分析からデオキシグアノシンとデオキシアデノシンのピークを統合.
調整曲線を確立するために領域を使用し、各注入されたサンプルの動物のデオキシグアノシンおよびデオキシアデノシンの量を計算します。デオキシグアノシン上の8-オキソ-デオキシグアノシンのモル分率を計算します, 1, デオキシアデノシンの上にN6-エテノデオキシアデノシン, 1, デオキシグアノシンの上にN2-エテノデオキシグアノシン, 100万個あたりの病変の数を与えます.HPLC-UVにより得られた精製DNAの代表的なクロマトグラムは、RNAリボヌクレオシドから解放された4つの正常なデオキシヌクレオシドの存在を示し、DNA純度を示す。
8-オキソ-デオキシグアノシンのHPLC-ESI-MS/MSからの代表的なクロマトグラム、1、N6-エテノデオキシアデノシン、および1、N2-エテノ-デオキシグアノシンをマウス組織のDNAサンプルに示す。UV検出で得られたクロマトグラムは、第1カラムから約10分間まで溶出する4つの正常なデオキシヌクレオシドを示し、8-オキソ・デオキシグアノシンから良好に分離して、望ましくない干渉を排除する。正確な定量化のために覚えておかなければならない重要なことは、キャリブレーションカーブとサンプルの注入量に常に同じ量の内部標準を持つということです。
ここで提示される方法は、他の修飾デオキシヌクレオシドの定量化に適合され得る。修飾されたデオキシヌクレオシドのバンドを拡大することは、基礎となる病態生理学的メカニズムのより良い理解を可能にする。異種生物への暴露、糖尿病、細胞悪性転換など、さまざまな状況における酸化的損傷の役割を調べ、予防および治療戦略の開発を支援することができます。
