La necrosis miofífica es característica de múltiples trastornos neuromusculares y desempeña un papel central en la patogénesis. Un método específico y confiable para evaluar la degeneración muscular es importante para el diagnóstico y la investigación traslacional. Esta técnica extremadamente adaptable permite el etiquetado de múltiples antígenos al mismo tiempo en la misma sección dentro de esa miofibras.
Es posible con tintes vitales. La tinción de H&E es un método empírico que no es adaptable para una conjugación fiable y reproducible. La tinción por absorción de IgG, sin embargo, es específica para las células musculares necróticas y aplicable a las biopsias humanas.
Esta técnica puede proporcionar información sobre todos los trastornos neuromusculares caracterizados por mionecrosis. Después de quitar el pelo de la pierna de interés colocar el animal mdx macho de cuatro semanas de edad en la posición supina y asegurar las patas a una tabla de corcho. Usando tijeras de precisión o fórceps, retire la piel de la pierna desde el pie hasta la rodilla para exponer toda la longitud de la tibia y tibialis anterior.
Utilice las tijeras para hacer una incisión entre la tibia y los tibialis anteriores. Utilice fórceps para eliminar cuidadosamente la capa de epimysium de la superficie del músculo. En el tobillo, usa los fórceps para aislar el tendón anterior de los tibialis de los otros tendones y tira suavemente hacia arriba en el tendón para aislarlo de la tibia y los músculos circundantes.
Cuando el vientre anterior tibialis se ha separado por completo, sostenga el tendón hacia arriba de modo que sólo la parte proximal del músculo anterior tibialis se une a la rodilla. Y corta suavemente el tendón proximal lo más cerca posible de la rótula. Coloque los tibialis anteriores sobre un trozo de gasa ligeramente humedecido con solución salina para evitar el secado.
Sumergir parcialmente un vaso de precipitados que contenga de 70 a 100 mililitros de isopentano en un recipiente de nitrógeno líquido hasta que el isopentano en la parte inferior del vaso de precipitados se convierta en un sólido blanco. Preetiquete cuidadosamente el otro lado de los corchos para que la biopsia pueda ser identificada correctamente después de la congelación, y agregue aproximadamente 0,5 mililitros de goma de tragacantth en una pieza circular de corcho de 20 por 11 por 8 milímetros. Use fórceps para incrustar los tibialis anteriores en el tendón distal de la encía hacia arriba.
Sosteniendo el músculo con su eje perpendicular a la superficie del corcho. Al menos la mitad del lado del tendón de la tibialis anterior debe permanecer descubierto por la encía. A continuación, sumerja rápidamente el corcho con el músculo incrustado en el isopentano frío y sin congelar durante unos dos minutos para permitir la congelación completa.
Obtener secciones del tejido congelado, ajustar la temperatura del criostato a menos 25 grados Celsius y utilizar un compuesto de temperatura de corte óptima para fijar el tejido en el bloque de corte de criostato. Recorte la muestra hasta que se alcance el vientre muscular. Obtenga de siete a 10 secciones de micrómetros que recojan al menos dos secciones por diapositiva de vidrio colocando los portaobjetos a temperatura ambiente a medida que se capturan las secciones.
Deje que los tejidos se sequen durante al menos 20 minutos a temperatura ambiente en un ambiente ventilado. A continuación, guarde la sección a menos 80 grados Celsius hasta que estén manchando. Inmunoetique los tejidos.
En primer lugar, descongele los portaobjetos a temperatura ambiente durante al menos 15 minutos en el ambiente ventilado. A continuación, delinear las secciones con una pluma hidrófoba. Fijar los tejidos con 2%paraformaldehído durante 10 minutos en una cámara húmeda.
Al final de una fijación enjuague las secciones con dos lavados de 5 minutos en PBS fresco por lavado. Bloquear cualquier unión no específica con 10% de suero de cabra diluido en PBS. Después de 1 hora a temperatura ambiente etiquetar las secciones con un anticuerpo primario de interés, diluido en 5%suero de cabra durante 2 horas a temperatura ambiente.
Al final de la incubación, enjuague los portaobjetos con tres lavados de 5 minutos en PBS siguiendo mediante el etiquetado con los anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforo apropiados durante 45 minutos a temperatura ambiente protegidos de la luz. Al final de la incubación, lave los portaobjetos con tres lavados de 10 minutos en PBS. Monte la sección con un medio de montaje fluorescente que contenga 100 nanogramos por mililitro de DAPI y un resbalón de cubierta.
Luego seque los portaobjetos durante la noche a cuatro grados Celsius antes de tomar imágenes. Los músculos anteriores de Tibialis de ratones mdx de cuatro semanas de edad a menudo muestran perfiles heterogéneos, incluyendo áreas mal afectadas en áreas degenerantes y regeneradoras juntas en la misma sección transversal. No afectados a las áreas musculares levemente afectadas contienen miofibers de un tamaño grande y homogéneo y núcleos a baja densidad que se encuentran principalmente en la periferia o entre miofibras.
Las miofibras igg positivas generalmente están ausentes en dicha salud o en áreas levemente afectadas, mientras que la inmunorreactividad IgG dentro de los miofibers indica mionecrosis. Los miofibers recién formados están presentes en un tamaño pequeño en sus primeras etapas de regeneración progresivamente agrandando a medida que los progenitores musculares se fusionan en contribuir a la célula sincitial. Durante este proceso, los mionúcleos permanecen en el centro del tejido regenerador con racimos de miofibres pequeños, centralmente nucleados que indican miofibers recientemente regenerados Para minimizar el riesgo de artefactos es importante mantener en los músculos rectos al congelar el tejido y a la temperatura correcta.
El isopentano y la PFA siempre deben manipularse con precaución y bajo una campana de humo.
