근섬유 괴사는 다중 신경 근육 장애의 특징이며 병인발생에 중심적인 역할을 합니다. 근육 변성을 평가하기위한 구체적이고 신뢰할 수있는 방법은 진단 및 번역 연구에 중요합니다. 이 매우 적응 가능한 기술은 근섬유 내의 동일한 섹션에서 동시에 다중 항원의 라벨링을 허용합니다.
그것은 중요한 염료로 가능합니다. H&E 염색은 안정적이고 재현 가능한 인주에 적응할 수 없는 경험적 방법입니다. IgG 섭취 염색, 그러나, 괴사 근육 세포에 대 한 특정 하 고 인간의 생검에 적용.
이 기술은 myonecrosis특징모든 신경 근육 장애에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 관심의 다리에서 머리를 제거 한 후 4 주 된 수컷 mdx 동물을 supine 위치에 배치하고 코르크 보드에 발을 고정시하십시오. 정밀 가위 또는 집게를 사용하여 다리 피부를 무릎으로 제거하여 경골과 티비알리스 전방의 전체 길이를 노출시합니다.
가위를 사용하여 경골과 티비알리스 전방 을 절개하십시오. 집게를 사용하여 근육 표면에서 에피미슘 층을 조심스럽게 제거하십시오. 발목에서, 다른 힘줄에서 티비알리스 전방 힘줄을 분리하고 경골과 주변 근육에서 분리하는 힘줄을 부드럽게 당기려면 집게를 사용합니다.
티비알리스 전방 배가 완전히 분리되면 힘줄을 들고 티비알리스 전방 근육의 근위 부분만 무릎에 부착되도록 합니다. 그리고 슬개골에 가능한 한 가깝게 근위 힘줄을 부드럽게 끊습니다. 건조를 피하기 위해 식염수로 가볍게 약해진 거즈 조각에 티비알리스 전방을 놓습니다.
비커의 바닥에 있는 이스펜탄이 백색 고체가 될 때까지 이스펜타네70 밀리리터의 70~100밀리리터를 액체 질소 용기에 부분적으로 담급니다. 코르크의 반대편을 주의 깊게 미리 라벨을 부착하여 생검을 동결 한 후 제대로 식별할 수 있도록 하고, 약 0.5 밀리리터의 트라가칸스 껌을 20~11mm의 코르크 원형 조각에 추가합니다. 집게를 사용하여 티비알리스 전방을 잇몸 말힘 쪽으로 삽입하십시오.
축이 코르크 표면에 수직으로 근육을 유지합니다. 티볼리스 전방의 힘줄 측면의 적어도 절반은 잇몸에 의해 밝혀져야 합니다. 그런 다음 코르크를 차가운 냉동되지 않은 디언타네에 넣고 약 2분 동안 완벽하게 동결할 수 있도록 빠르게 찍어줍니다.
냉동 조직의 단면을 얻고, 극저온 온도를 영하 25도로 설정하고 최적의 절삭 온도 화합물을 사용하여 조직을 극저온 절단 블록에 고정시하십시오. 근육 배에 도달 할 때까지 샘플을 손질. 섹션이 캡처될 때 유리 슬라이드당 최소 2개의 섹션을 수집하는 7~10마이크로미터 섹션을 얻을 수 있습니다.
통풍이 잘되는 환경에서 실온에서 적어도 20분 동안 티슈가 건조하도록 합니다. 그런 다음 섹션이 얼룩될 때까지 섭씨 영하 80도에 보관하십시오. 조직을 면역 라벨.
첫째, 환기 환경에서 적어도 15 분 동안 실온에서 슬라이드를 해동하십시오. 다음으로 소수성 펜으로 섹션을 설명합니다. 습한 챔버에서 10 분 동안 2 %의 paraformaldehyde로 조직을 수정합니다.
고정의 끝에서 세척 당 신선한 PBS에 두 5 분 세척으로 섹션을 헹구는. PBS에서 희석된 10%의 염소 혈청으로 비특이적 결합을 차단합니다. 실온에서 1 시간 후 관심의 1 차적인 항체를 가진 단면도를 표시하고, 실온에서 2 시간 동안 5% 염소 혈청으로 희석시.
인큐베이션이 끝나면 PBS에서 35분 세척으로 슬라이드를 헹구면 빛으로부터 보호되는 실온에서 45분 동안 적절한 플루오로포레 컨쥬게이징된 이차 항체로 라벨을 부착하여 다음과 같습니다. 인큐베이션이 끝나면 PBS에서 10분 동안 3개의 세척으로 슬라이드를 씻습니다. DAPI의 밀리리터당 100 나노그램과 커버 슬립을 포함하는 형광 장착 매체로 단면을 장착하십시오.
그런 다음 이미징 전에 섭씨 4도에서 밤새 슬라이드를 건조시십시오. 4주 된 mdx 마우스의 티비알리스 전방 근육은 종종 동일한 단면에서 함께 퇴행성 및 재생 영역에서 제대로 영향을 받지 않는 부위를 포함한 이질적인 프로파일을 표시합니다. 약간 영향을 받는 근육 영역에 영향을 받지 않는 근섬유는 크고 균일한 크기와 핵을 주로 주변또는 근섬유 사이로 위치하는 저밀도에서 함유되어 있습니다.
IgG 양성 심근섬유는 일반적으로 이러한 건강 또는 약간 영향을받는 부위에 존재하지 않으며 근섬유내의 IgG 면역 반응성은 myonecrosis를 나타냅니다. 새로 형성된 근섬유는 근육 전구가 동기화 세포에 기여함에 따라 점진적으로 확대되는 재생초기 단계에서 작은 크기로 존재한다. 이 과정에서, 근핵은 작고 중앙에 핵화된 근섬유의 클러스터를 가진 재생 조직의 중심에 남아 있으며 최근에 재생된 심섬유를 나타내며, 유물의 위험을 최소화하기 위해 조직을 동결할 때 와 올바른 온도에서 근육에 똑바로 유지하는 것이 중요합니다.
이스펜탄과 PFA는 항상 주의깊게 그리고 연기 후드 아래에서 처리되어야 합니다.
