Disección de las solas fibras de músculo esquelético para los análisis inmunofluorescentes y morfométricos de entero-monte las ensambladuras neuromusculares. Este video demostrará un protocolo para diseccionar de manera efectiva y segura los músculos EDL y sóseo con un enfoque repetible. Este video también enseñará cómo obtener uniones neuromusculares de montaje completo con el objetivo de reconocer componentes sinápticos con integridad 3D para permitir un análisis morfométrico preciso.
Para diseccionar los músculos, estos instrumentos quirúrgicos son necesarios. Para iniciar el procedimiento, coloque al animal con el abdomen hacia arriba. Haga una incisión inicial usando una cuchilla quirúrgica entre los dedos de los dedos hacia las extremidades posteriores.
Desprenda la piel, tirando hacia arriba hasta que la rodilla derecha esté expuesta. Para encontrar el EDL, siga los tendones del pie hasta el ligamento anular. Este ligamento rodea dos tendones.
Corte el ligamento con las tijeras Uniband entre los dos tendones. Identifique el tendón EDL levantando ambos y viendo cuál hace que los dedos de los dedos se muevan hacia arriba. Cortar el tendón con tijeras.
Mientras sostiene el tendón con pinzas biológicas, comience a separar lentamente el músculo EDL de los otros músculos de las extremidades posteriores. La separación del músculo sin causar daño se puede hacer haciendo varios cortes en el resto de los músculos laterales para abrir un camino entre ellos, mientras se mantiene y se levanta el músculo de la sección de división del tendón EDL. Para aislar completamente el músculo, corte el tendón que está unido a la rodilla de la rata usando tijeras Uniband.
Sumerja el músculo diseccionado en la solución fijadora y déjelo durante 24 horas a cuatro grados centígrados. En general, es útil tener un músculo alargado. Para hacer esto, use cartón y grapas para unir el músculo para la fijación.
Para aislar el músculo sóleo, voltee al animal. A través de la piel, corte el tendón calcáneo usando una cuchilla quirúrgica. Con la ayuda de las pinzas biológicas y las tijeras Uniband, separe el músculo gastrocnemio de los huesos, creando una tapa muscular.
El sóleo estará en el lado interno de la tapa muscular. Se puede identificar porque es rojo y plano. Con un par de pinzas biológicas, alcanzar y levantar el tendón del sóseo que se encuentra por encima del gastrocnemio anterior.
Cortar el tendón con tijeras Uniband. Levante todo el músculo mientras corta algunos de los puntos de unión débiles. Finalmente, para liberar completamente el músculo sóseo, corte la vesícula del sóseo que forma el tendón calcáneo.
Repita el paso de fijación como se hace con el músculo EDL. Para usar este método, es importante asegurar las grapas a los tendones y no al músculo. Una vez que haya pasado el período de 24 horas de fijación, enjuague los músculos en la solución de DPBS antes de comenzar a aislar las fibras musculares.
Para aislar las fibras, sostenga suavemente uno de los tendones con un par de pinzas biológicas. Luego, con el otro par de pinzas biológicas, comience a pellizcar lentamente el tendón para separar las fibras musculares. Para aislar las fibras, tire lentamente hacia arriba hacia el tendón muscular opuesto.
Será necesario repetir esta acción varias veces hasta obtener múltiples, pequeños, paquetes aislados. Una vez separados en pequeños haces aislados, colócales cuidadosamente en un portaobjetos silanizado pre-tratado. Es necesario mantener todas las fibras ordenadas para que no se superpongan.
En este punto, las fibras se pueden dejar secar al aire durante 24 horas. Después de 24 horas, comience la inmunotención. Para crear una barrera impermeable, utilice una pluma pap para rodear las fibras musculares aisladas en el tobogán pretratado.
Éste es un ejemplo de una imagen confocal de alta resolución que se puede obtener siguiendo el protocolo descrito aquí. En la parte superior izquierda, se muestra el elemento post-sináptico, y en la parte superior derecha, el elemento pre-sináptico, mientras que las imágenes inferiores muestran los componentes sinápticos esquematizados con el fin de ilustrar los parámetros que se utilizarán para el análisis morfométrico. La segunda diapositiva muestra la fusión de las señales pre y post-sinápticas con la mancha de núcleos de la API.
Las diferencias entre las uniones neuromusculares de animales transgénicos y animales no transgénicos son claramente visibles. El análisis morfométrico de las uniones neuromusculares muestra evidencia de la señal post-sináptica en animales transgénicos y parece ser más compacto, principalmente debido a la reducción del área total de la unión neuromuscular. Como se muestra aquí, el área presináptica de la unión neuromuscular del animal transgénico se reduce.
El más pequeño detectado fue el encontrado con señal de neurofilamento antifosforilado, como se muestra en la imagen B, por ejemplo. La última imagen muestra los resultados relacionados con el estado de las uniones neuromusculares de montaje completo. Utilizando el índice de cobertura, se estableció que las uniones neuromusculares transgénicas se encontraron parcialmente desnervadas.
Asimismo, se podría determinar que la cobertura y nexo del neurofilamento fosforilado es menor que la obtenida cuando se detecta un neurofilamento no fosforilado. El protocolo propuesto permite obtener preparaciones de unión neuromuscular de alta calidad a partir de fibras musculares lentas y rápidas. Los componentes neuromusculares pre y post-sinápticos de la ensambladura fueron identificados por las puntas de prueba o los anticuerpos específicos, y después fotodados en microscopia confocal o de la super-resolución confocal, permitiendo análisis morfométrico en una escala micrométrica.
