La necrosi del miofibra è caratteristica di molteplici disturbi neuromuscolari e svolge un ruolo centrale nella patogenesi. Un metodo specifico e affidabile per valutare la degenerazione muscolare è importante per la diagnosi e la ricerca traslizionale. Questa tecnica estremamente adattabile consente l'etichettatura di più antigeni contemporaneamente nella stessa sezione all'interno di quella miofibra.
È possibile con coloranti vitali. La colorazione H&E è un metodo empirico che non è adattabile per coniugazione affidabile e riproducibile. La colorazione di assorbimento IgG, tuttavia, è specifica per le cellule muscolari necrotiche e applicabile alle biopsie umane.
Questa tecnica può fornire informazioni su tutti i disturbi neuromuscolari caratterizzati da miocrosi. Dopo aver rimosso i capelli dalla gamba di interesse, posizionare l'animale mdx maschio di quattro settimane in posizione supina e fissare le zampe a una tavola da sughero. Utilizzando forbici o forcep di precisione rimuovere la pelle della gamba dal piede al ginocchio per esporre l'intera lunghezza della tibia e del tibiale anteriore.
Usa le forbici per fare un'incisione tra la tibia e il tibiale anteriore. Utilizzare le forcep per rimuovere con cura lo strato di epimisio dalla superficie del muscolo. Alla caviglia, utilizzare le flessioni per isolare il tendine anteriore tibiale dagli altri tendini e tirare delicatamente sul tendine per isolarlo dalla tibia e dai muscoli circostanti.
Quando la pancia anteriore tibialis si è completamente separata tenere il tendine in alto in modo che solo la parte prossimale del muscolo anteriore tibiale sia attaccata al ginocchio. E premere delicatamente il tendine prossimale il più vicino possibile alla rotula. Posizionare la tibialis anteriore su un pezzo di garza leggermente inumidito con soluzione salina per evitare l'asciugatura.
Immergere parzialmente un becher contenente da 70 a 100 millilitri di isopentane in un contenitore di azoto liquido fino a quando l'isopentane nella parte inferiore del becher diventa un solido bianco. Pre-etichettare con cura l'altro lato dei tappi in modo che la biopsia possa essere correttamente identificata dopo il congelamento e aggiungere circa 0,5 millilitri di gomma tragacante su un pezzo circolare di sughero da 20 per 11 per 8 millimetri. Utilizzare le flessione per incorporare la tibialis anteriore nel tendine distale gengivale verso l'alto.
Trattenere il muscolo con il suo asse perpendicolare alla superficie del sughero. Almeno la metà del lato tendineo del tibiale anteriore dovrebbe rimanere scoperta dalla gomma. Quindi immergere rapidamente il sughero con il muscolo incorporato nell'isopentane refrigerato e scongelato per circa due minuti per consentire il congelamento completo.
Ottenere sezioni del tessuto congelato, impostare la temperatura del criostato a meno 25 gradi Celsius e utilizzare un composto di temperatura di taglio ottimale per fissare il tessuto sul blocco di taglio criostato. Tagliare il campione fino a raggiungere la pancia muscolare. Ottenere da sette a 10 sezioni di micrometro raccogliendo almeno due sezioni per scivolo di vetro posizionando le diapositive a temperatura ambiente man mano che le sezioni vengono catturate.
Lasciare asciugare i tessuti per almeno 20 minuti a temperatura ambiente in un ambiente ventilato. Quindi conservare la sezione a meno 80 gradi Celsius fino a quando non vengono macchiati. Etichettare immunolabel i tessuti.
In primo luogo, scongelare gli scivoli a temperatura ambiente per almeno 15 minuti nell'ambiente ventilato. Quindi, delineare le sezioni con una penna idrofobica. Fissare i tessuti con paraformaldeide al 2% per 10 minuti in una camera umida.
Al termine di una fissazione sciacquare le sezioni con due lavaggi di 5 minuti in PBS fresco per lavaggio. Bloccare qualsiasi legame non specifico con siero di capra al 10% diluito in PBS. Dopo 1 ora a temperatura ambiente etichettare le sezioni con un anticorpo primario di interesse, diluito nel siero di capra al 5% per 2 ore a temperatura ambiente.
Al termine dell'incubazione, sciacquare gli scivoli con tre lavaggi di 5 minuti in PBS seguire etichettando con gli anticorpi secondari coniugati al fluoroforo appropriati per 45 minuti a temperatura ambiente protetti dalla luce. Al termine dell'incubazione, lavare gli scivoli con tre lavaggi di 10 minuti in PBS. Montare la sezione con un supporto di montaggio fluorescente contenente 100 nanogrammi per millilitro di DAPI e uno slittamento di copertura.
Quindi asciugare gli scivoli durante la notte a quattro gradi Celsius prima dell'imaging. I muscoli anteriori tibiali di topi mdx di quattro settimane mostrano spesso profili eterogenei tra cui aree scarsamente colpite in aree degenerate e rigeneranti insieme nella stessa sezione trasversale. Le aree muscolari non colpite da quelle leggermente colpite contengono miofibre di grandi dimensioni e omogenee e nuclei a bassa densità che si trovano principalmente alla periferia o tra le miofibre.
Le miofibre positive IgG sono generalmente assenti in tale salute o in aree leggermente colpite, mentre l'immunoreattività IgG all'interno delle miofibre indica la miocrosi. Le miofibre appena formate sono presenti in piccole dimensioni nelle loro prime fasi di rigenerazione che si allargano progressivamente man mano che i progenitori muscolari si fondono nel contribuire alla cellula sincreziale. Durante questo processo, i mionuclei rimangono al centro del tessuto rigenerante con gruppi di piccole miofibre nucleate centralmente che indicano miofibre rigenerate di recente Per ridurre al minimo il rischio di artefatti è importante mantenere i muscoli dritti quando si congela il tessuto e alla temperatura corretta.
Isopentane e PFA devono sempre essere maneggiati con cautela e sotto una cappa aspirante.
