Este protocolo es significativo porque nos permite visualizar el microambiente donde las células producen una citoquina dada, aquí, interferón gamma. Se admite que el rango de acción de las citoquinas es limitado porque los tejidos son tan complejos. Es importante caracterizar las células que rodean las células productoras de interferón gamma para identificar qué células lo tomarán.
La principal ventaja de la técnica es que no interrumpe el microambiente presente en el tejido de interés. Además, debido a que no restulamos artificialmente las células para forzarlas a producir interferón gamma, nos da una mejor caracterización de si las células realmente producen activamente interferón gamma in situ. Este protocolo podría adaptarse potencialmente a otros órganos y para la visualización de otras citoquinas.
La mayoría de los pasos de este protocolo son simples, pero el manejo del tejido, la congelación y la sección, deben realizarse con cuidado para preservar la integridad del tejido. Para empezar, transfiera 300 microlitros de LM cultivados genéticamente modificados para expresar OVA a una infusión de corazón de caldo a 37 grados Celsius en un matraz. Coloque el matraz en una coctelera para una agitación suave para que el LM crezca a una fase exponencial hasta que el OD600 alcance 0.08 a 0.1.
Después de diluir el cultivo de LM OVA en PBS a una concentración de 0,1 veces dosis letal, el 50% utiliza una jeringa de insulina de calibre 29 para inyectar por vía intravenosa 100 microlitros en receptores de ratones C57 negros de 6 de tipo salvaje que llevan células OT1 GFP u OT1 RFP. Para bloquear la secreción de citoquinas 6 horas antes del sacrificio del ratón, inyecte 250 microgramos de BFA y 200 microlitros de PBS intraperitonealmente con la jeringa de insulina del calibre 29. Después de la eutanasia de ratones usando dióxido de carbono y posterior luxación cervical, limpie el abdomen con 70%etanol.
En el flanco izquierdo del ratón donde se encuentra el bazo, corta la piel con tijeras para hacer una incisión de uno a dos centímetros. Luego, haga cuidadosamente una incisión en el peritoneo para exponer el bazo y sacarlo con pinzas. Tenga cuidado de no apretarlo con fórceps o cortarlo para evitar interrumpir la arquitectura del bazo.
Ahora, preparar la solución fijadora mezclando 3.75 mililitros de PBS y 3.75 mililitros de 0.2 molar L-lisina. Añadir 21 miligramos de m-periodato de sodio y mezclar bien. A continuación, añadir 2,5 mililitros de 4%PFA y 20 microlitros de 12 hidróxido de sodio normal.
Corta el bazo en tres partes. Sumerja el bazo en el fijador en una placa de seis pozos y fíjelo durante un mínimo de cuatro horas. Un período de fijación típico es de 16 a 20 horas a cuatro grados Celsius bajo agitación suave.
Después de eso, deseche la solución fijadora y agregue cinco mililitros de PBS durante cinco minutos a temperatura ambiente bajo agitación suave. Luego, reemplace el PBS con cinco mililitros de 30%sacarosa e incubar durante 12 a 24 horas para mantener la morfología tisular. Ahora, el órgano se hunde en la parte inferior de la placa.
Para congelar la muestra, coloque hielo seco en un recipiente grande y coloque un recipiente más pequeño en su interior que contenga alrededor de 50 mililitros de metanol puro y unos trozos de hielo seco. Seque suavemente el bazo en una toallita sin pelusas. Gotee una gota de compuesto OCT en la parte inferior del molde base y coloque el bazo dentro del molde.
Tenga cuidado de no producir burbujas. Agregue aproximadamente un mililitro de OCT sobre el bazo. Con fórceps, deposite el molde base en la superficie del metanol en el baño de hielo seco, asegurándose de que el metanol no toque el OCT.
El OCT se espesará y se volverá blanco cuando se congela. Recuerde congelar el tejido lo más rápido posible para minimizar los artefactos. En un criomicrotoma, ajuste a la temperatura de menos 20 grados Celsius.
Secise el tejido al grosor deseado, alrededor de 10 micrómetros. Utilice un cepillo para recoger secciones en diapositivas de microscopio de vidrio e inspeccione visualmente. Deje que las secciones lleguen a temperatura ambiente.
Dibuje un círculo con bloqueador de líquidos, por ejemplo, una pluma PAP, alrededor de la sección de tejido fuera del OCT. Una vez que el tejido se haya secado, rehidrate la muestra goteando 100 microlitros de PBS en la sección del tejido durante cinco minutos. A continuación, retire el PBS de la sección por aspiración y agregue 100 microlitros de solución de bloqueo por sección de muestra.
Incubar en una cámara húmeda cubierta durante un mínimo de una hora a temperatura ambiente. Para manchar con anticuerpos primarios, sustituya la solución de bloqueo por la mezcla de anticuerpos primarios preparada para cada muestra. Incubar durante cuatro horas a temperatura ambiente o durante la noche a cuatro grados Celsius en una cámara húmeda cubierta antes de lavar de acuerdo con el manuscrito.
Ahora, diluir los anticuerpos secundarios de interés a una concentración óptima, generalmente 2,5 microgramos por mililitro, en la solución de bloqueo. Retire la solución de lavado final de la sección y agregue la mezcla de anticuerpos secundaria preparada en la parte superior de la sección e incubar durante una o cuatro horas a temperatura ambiente en una cámara húmeda cubierta. Después de lavar con tampón de lavado según el manuscrito, retire la solución de lavado y realice un lavado final con PBS.
Aspirar la solución salina tamponada con fosfato y permitir que el PBS restante se evapore sin que la sección se seque por completo. Dibuja un círculo alrededor de la sección en la parte posterior de la diapositiva. A continuación, coloque una gota del medio de montaje en la parte superior de la muestra, asegurándose de que el medio cubra toda la sección y coloque cuidadosamente un vaso de cubierta en la parte superior.
Deje que la muestra de polimerasa durante la noche a temperatura ambiente en la oscuridad. Por la mañana, coloque la diapositiva debajo de un microscopio de escaneo láser espectral invertido. Ajuste el objetivo a 10x NA 0.40 o 60x NA 1.4 para el análisis de la localización subcelular de citoquinas.
En este protocolo, las células que producen interferón gamma se visualizan y se localizan. El marcador F4/80 etiqueta todos los macrófagos y resalta la pulpa roja. El marcador B220 etiqueta las células B y resalta los folículos de células B que rodean la zona de células T.
El marcador CD169 etiqueta los macrófagos de zona marginal que rodean la pulpa blanca. 24 horas después de la infección, el interferón gamma es producido por múltiples células, incluyendo células T OT1 CD8 específicas del antígeno activado y células NK. Sin el uso de BFA para inhibir la secreción de citoquinas, la detección de interferón gamma por las células NK se vio muy deteriorada.
Las células B, los macrófagos de la zona marginal y todos los macrófagos se teñiron para delinear la ubicación de las células productoras de interferón gamma después de la infección por OVA. Curiosamente, se encontraron células T específicas de antígenos agrupados ubicadas a lo largo de la pulpa blanca del bazo, pero producen interferón gamma sólo en regiones donde las células NK coexistían con ellas. Se mostró una localización subcelular diferente de interferón gamma y NK frente a células T positivas CD8.
Mientras que la localización gamma de interferón en las células NK se difundió en el citosol, las células T positivas CD8 a menudo reclutaban interferón gamma hacia otra célula T. La inyección de brefeldina A es crucial para detectar la citoquina in situ. Las células a menudo se secretan rápidamente y toman las citoquinas y necesitamos inhibir la secreción de citoquinas para dejar que se acumule en las células.
Este método es una herramienta de descubrimiento que coloca de nuevo las células productoras de citoquinas en su entorno nativo. Descifrar la composición de este entorno nos permite centrarnos en las células adecuadas o mediadores inmunes presentes en este lugar que pueden impactar o verse afectados por el interferón gamma. Existe una creciente comprensión de que la localización precisa de una célula en un tejido es crucial para su función.
Nuestro protocolo nos permite identificar la localización de las células productoras de citoquinas y así caracterizar aún más su función.
