El Wellcome Trust proporcionó apoyo financiero (Premio VIP para JSY y 074.128 becas de investigación a KLB). Consejo de Investigación Médica Beca de RJA Leica_SP2_Stacker, un algoritmo que se utiliza para importar archivos TIFF para la &quot;reconstrucción&quot; en una serie, se basa en Leica_tiff_sequence, un plugin para leer archivos TIFF Leica SP2 en ImageJ, desarrollado por Tony Collins y utilizado con su permiso. ( <a href="http://www.uhnres.utoronto.ca/facilities/wcif/software/Plugins/LeicaTIFF.html">http://www.uhnres.utoronto.ca/facilities/wcif/software/Plugins/LeicaTIFF.html</a> ) StackReg y TurboReg, los algoritmos utilizados para corregir el movimiento de los tejidos, se basan en Th venaz y sus colegas (1998) 9. Excel_writer.jar fue escrita por Kurt De Vos (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/excel-writer.html). JNCT0.08JoVE.ijm, el algoritmo de detección de partículas, se basa en un algoritmo escrito por KL cerebro y detallado anteriormente 5.

Parte 1: Preparación de la Ca 2 + indicador (Oregon Green 488 BAPTA-1 AM) <ol><li> Oregon Green 488 BAPTA-1 AM se presenta en frascos de 500 l como una pequeña cantidad (50 g) de polvo. Añadir 40 l Pluronic F-127 solución para el polvo, agitando suavemente durante 30 s, a continuación, añadir 460 l PSS, y agite suavemente durante 30 s. La solución final, 10 M Oregon Green 488 BAPTA-1 AM, dispone de 4 x 125 alícuotas. Evite la exposición a la luz y almacenar a -20 º C. </li></ol> Parte 2: Ca 2 + carga <ol><li> Quitar el indicador de Ca 2 + (Oregon Green 488 BAPTA-1 AM) del congelador (-20 ° C) y dejar descongelar a temperatura ambiente. </li><li> Tomar 1 ml de PSS en un tubo de ensayo y coloque en baño de María. Burbuja con 95% O 2 / 5% CO 2 a una velocidad de alrededor de una burbuja que aparece por segundo. El burbujeador debe ser asegurado en el tubo de ensayo, por ejemplo, con un tapón o con Parafilm. </li><li> Disecar el tejido del animal y, en una placa de Petri Sylgard forrados, retire con cuidado el tejido conectivo. Independientemente del tipo de músculo liso de órganos, PSS debe ser reemplazado cada 10 minutos y los tejidos deben ser bien lavadas (por ejemplo, mediante la sustitución de la PSS tres veces) la disección siguiente. Para los conductos deferentes: considere cortar el órgano de longitud maneras de producir una capa de tejido. De la vejiga urinaria, se abre longitudinalmente desde el cuello de la vejiga (posterior) de la parte superior de la cúpula (anterior). Prepare cuatro tiras, 6 - 8 mm de largo y 1 a 2 mm de ancho, a lo largo de la superficie dorsal del detrusor, el corte en la dirección de los haces musculares dominantes. </li><li> Lugar en la disección de tejidos pre-calentado y burbujas &#39;PSS. </li><li> Añadir 125 l de 10 mM Oregon Green 488 BAPTA-1 AM para el tubo de ensayo y darle una pequeña sacudida, a mano, mezclar. </li><li> Reanudar burbujas y se van, cubierto con papel aluminio. El tiempo que tarda para el tejido suficiente para asumir el Ca 2 + indicador varía según el tamaño del tejido y el espesor de la capa de músculo liso. Por ejemplo: 70 minutos (ratón detrusor, anococcygeus rata) a 120 minutos (detrusor rata, conducto deferente de ratón). </li></ol> Parte 3: Preparación de la &#39;Ca 2 + cargado&#39; de tejidos para microscopia Cuidado de fijación del tejido es necesario con el fin de minimizar el movimiento espontáneo de los tejidos (propiedad de las imágenes de las células del músculo liso del tejido relativamente intacto) y para facilitar la localización de un lugar adecuado para la imagen (como un pedazo de tejido puede ser encuestados en dos dimensiones, en lugar de tres). <ol><li> Enjuague el tejido en el PSS burbujas durante al menos 5 minutos. </li><li> Montar en un plato de preparación Sylgard forrado, que se extiende el tejido (un poco) para formar una lámina plana. Evite el uso de largo plazo &quot;pasadores&quot; que puedan rayar el objetivo, el uso de longitudes cortas en vez de 25 a 50 micras de plata de alambre de diámetro como &#39;pasadores&#39; e insertar en un ángulo. </li><li> Coloque el plato de preparación en la platina del microscopio, con cuidado para asegurarse de que la PSS no se escapa de la zona Sylgard revestidos de la antena (ya que esto puede conducir a una gran superficie que se cubre en el PSS, cuando el superfusión comienza). </li><li> Encienda la bomba con el fin de superfuse la preparación con PSS. A razón de 100 ml por hora se emplea a menudo. </li><li> Encender el aparato calefactor. </li><li> Coloque los tubos de entrada y salida y la sonda de temperatura en el plato preparado (colocación de cada uno para la banda de metal por el imán en su base). La altura de la punta del tubo de salida se determinará la profundidad de la PSS. Tenga cuidado para asegurarse de que la salida es en realidad la eliminación de PSS (ya que a veces no al principio). </li><li> Ajuste la temperatura en la unidad de calefacción para alcanzar la temperatura deseada, por ejemplo, 33 a 35 C. </li><li> Permitir que el tejido en reposo durante al menos 10 minutos. </li></ol> Parte 4: Selección del sitio de la imagen La exposición a la luz de excitación se photobleach el indicador, por lo que evitar el uso de más de unos pocos segundos a la vez. <ol><li> Con un objetivo de baja potencia (10x o 20x) el uso de epifluorescencia emocionante, con una luz azul, para ver el músculo liso e identificar una región adecuada para controlar. Trate de elegir un sitio basado en: el movimiento (que debe ser mínimo) y el número de células del músculo liso en el campo. &quot;Estructuras&quot; brillantes pueden causar un alto número de &quot;falsos positivos&quot; en el algoritmo de detección de imágenes, así que evite lugares con un gran número de (por ejemplo) intercalados células epiteliales o los fibroblastos. </li><li> Cambiar a un objetivo de mayor potencia (40x). </li><li> Gire el escenario o el eje óptico por lo que la célula del músculo liso (s) se encuentra horizontal (es decir, paralelo al eje de exploración rápida). </li></ol> Parte 5: La microscopía confocal Los detalles de cómo el microscopio confocal es &#39;crear&#39; son específicos para cada tipo de microscopio, perolas consideraciones más importantes son: velocidad (mínimo de 5 Hz se requiere para la mayoría de los transitorios de Ca 2 +), la resolución y el tamaño de campo (dos de los cuales son objeto de comercio-off con la velocidad). Algunos de los siguiente protocolo es específico de un microscopio confocal Leica SP2 en posición vertical. Un protocolo típico es: 100 series cuadro, adquirido a 5 Hz (256 x 256 píxeles, aproximadamente 100 x 100 micras.) O 13,5 Hz (256 x 64 píxeles, unos 100 x 25 m.). La cabeza de lectura conjunto para mover de forma bidireccional (para maximizar la velocidad de adquisición) y adquirir a 1000 Hz en cada línea. <ol><li> Cerrar el agujero de un &quot;disco de Airy. </li><li> Ajuste el láser (488 nm) de energía entre un 25 y un 35% en el AOTF, este valor es un trade-off entre el brillo y photobleaching. (Este último es un problema particular durante grabaciones de larga duración). </li><li> Adquisición de seis series por cada sitio, y desde cuatro hasta seis sitios por &quot;tratamiento&quot;. Es común la intención de observar los mismos seis sitios pre-droga (&quot;control&quot; es decir) y después de las drogas, a pesar de photobleaching significativas puede provocar que el experimentador se apartan de esto. </li><li> Es esencial con Ca 2 + de imágenes que &quot;los controles de tiempo&quot; se llevan a cabo. </li></ol> Parte 6: Preparación para el análisis <ol><li> Descargue e instale el J Imagen de: http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html. Descargue la versión específica de la plataforma, y ​​luego actualizar a la última versión descargando el último archivo de imageJ.jar de http://rsb.info.nih.gov/ij/upgrade/ij.jar, sustituyendo el viejo archivo. Los usuarios de Apple Mac: si se ejecuta lentamente, asegúrese de estar usando la última versión de la máquina virtual de Java (JVM), disponible en Apple (http://www.apple.com/macosx/features/java/). </li><li> Descargar Excel_writer.jar de: http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/excel-writer.html e instalar plugins en el [directorio] directorio jar&gt;. </li><li> Copie los siguientes archivos en el directorio Plugins: Leica_SP2_Stacker.class; JNCT0.08Release.ijm. Instalar cada una de estas secuencias de comandos con los plugins [Menú]&gt; Macros&gt; Instalar ... en función de ImageJ. </li><li> Nosotros usamos un microscopio confocal Leica SP2, el software (Leica LCS) para los que genera cada serie como un único visible &quot;película&quot; en el software, pero guarda como cuadros individuales. Para reconstruir los marcos en la serie: (i) Asegúrese de que todos los &quot;marcos&quot; para ser reconstruido en una sola carpeta (por ejemplo, &quot;DataFolder&gt; Tiffs &#39;). (Ii) Seleccionar Plugins [Menú]&gt; Macros&gt; Leica_SP2_Stacker. Seleccione el directorio raíz (por ejemplo, &quot;DataFolder &#39;). Seleccione la carpeta que desee en la lista desplegable (&quot;Tiffs / &#39;por ejemplo). Seleccione un directorio de salida o generar una nueva (&quot;DataFolder&gt; Pilas&quot;, por ejemplo). La secuencia de comandos a reconstruir la serie de imágenes individuales. </li></ol> Parte 7: Corrección para el movimiento Aunque el movimiento de las imágenes del sitio pueden minimizarse con una buena fijación y el tejido uniformemente extendido, algunos órganos del músculo liso presentan contracciones espontáneas que no puede ser abolida por cuidado depositadas en paz. A continuación se describe el uso de un algoritmo de libre disposición que se alinea o partidos marcos dentro de una serie. <ol><li> Download &#39;StackReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) y&#39; TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/). </li><li> Instalar cada uno en el directorio de plugins usando los plug-ins&gt; Macros&gt; Instalar ... </li><li> Cargue una pila para ser procesado (Archivo&gt; Abrir ...) y luego pasar a un marco que muestra claramente el campo de interés. Otros marcos se alinearán con este marco de referencia. </li><li> Plugins&gt; Pilas&gt; StackReg. Intente cada uno de los diferentes &quot;transformaciones&quot; (es decir, traducción, cuerpo rígido, rotación escalado, afines) para determinar lo que es más eficaz. (Más detalles: http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) </li></ol> Parte 8: algoritmo de detección de partículas Para cada &quot;sitio&quot; imágenes, los factores variarán que afectan a la detección de Ca 2 + transitorios. Mediante la medición de ciertas propiedades de cada sitio (los &quot;parámetros de partículas&quot; - se detalla a continuación), el proceso de detección es más sencilla. Así, por cada sitio, se calcula &quot;umbral de restar&quot;, &quot;el umbral para la relación&quot; y &quot;umbral borde de la celda. <ol><li> Plugins [Menú]&gt; Macros&gt; Instalar ... y seleccione &#39;JNCT0.08Release.ijm. </li><li> Plugins [Menú]&gt; Macros&gt; pila de carga (acceso directo: l). Seleccionar una serie y calcular los parámetros de las partículas: <ol style="list-style:none;"><li> a. Umbral para la resta (fondo =) </li></ol></li><li> Seleccione un ROI rectangular sobre lo que usted cree que es &quot;de fondo&quot;. </li><li> Medida (acceso directo: m). Tome nota de media. <ol style="list-style:none;"><li> b. Calcular el umbral para la relación </li></ol></li><li> Seleccione un rectangularRetorno de la inversión en torno a un área ópticamente plana de la célula (s). </li><li> Medida (acceso directo: m). Nota DESVIACIÓN por media y estándar. </li><li> Repita dos veces más O se puede dibujar tres cajas a la vez pulsando la tecla &#39;shift&#39;. </li><li> Calcular y anotar el umbral para la relación = (1 + SD / media) x 32, con un promedio de los valores de las tres repeticiones / sitios. <ol style="list-style:none"><li> c. Celular umbral límite </li></ol></li><li> Imagen&gt; Pilas&gt; Z proyecto ... Elige el tipo de proyección: &quot;intensidad media&quot; </li><li> Imagen&gt; Ajustes&gt; Umbral. </li><li> Seleccione en blanco y negro. </li><li> Define &#39;bajo&#39; (deslizador superior) límite y anotar el valor correspondiente (a la derecha de la barra). Sólo los eventos que ocurren en las regiones negro será contado. </li><li> Haga clic en &#39;reset&#39;. </li><li> Analizar las pilas (acceso directo: 2) </li><li> Seleccionar sólo una serie en esta etapa, es decir, el archivo &#39;primero&#39; y &#39;el último archivo &quot;debe ser el mismo. </li><li> Introduzca los valores de &quot;umbral de restar&quot;, &quot;umbral de proporción&quot; y &quot;umbral borde de la celda. Deje las otras opciones en sus valores predeterminados. </li><li> El algoritmo se produce una ventana de doble panel en el que se muestra la serie de tratados sobre la izquierda y el original a la derecha. Lea cuidadosamente a través de este para evaluar el número de falsos positivos y las ocasiones en que los acontecimientos, visible a simple vista, no se han detectado. Para conseguir una detección más precisa de los transitorios de Ca 2 +, puede ser necesario ajustar ligeramente algunos de los &quot;parámetros de partículas&quot;. Si bien el proceso puede parecer un poco &quot;al azar&quot; en el primer intento, rápidamente consigue una sensación en cuanto a cuáles son los parámetros clave. </li><li> Para cada serie, el algoritmo genera un archivo de Excel que detalla las características de los eventos detectados (tales como la amplitud, extensión y posición). &#39;Falsos positivos&#39; - identificado mediante la revisión de los archivos de imagen que el algoritmo de salidas (por ejemplo, paso 8.17) - se puede quitar, a mano, a partir de este archivo de Excel. </li></ol>

<ol>
	<li>Haugland, R. P., Gregory, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indicators+for+Ca2+,+Mg2+,+Zn2++and+other+metal+ions.">Indicators for Ca2+, Mg2+, Zn2+ and other metal ions.</a> Handbook of fluorescent probes and research products. , 771-826 (2002).</li><li>Boland, B., Himpens, B., Gillis, J. M., Casteels, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+force+and+Ca2++in+anococcygeal+and+vas+deferens+smooth+muscle+cells+of+the+mouse.">Relationship between force and Ca2+ in anococcygeal and vas deferens smooth muscle cells of the mouse.</a> Pflugers Arch. 421, 43-51 (1992).</li><li>Hashitani, H., Fukuta, H., Takano, H., Klemm, M. F., Suzuki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+propagation+of+spontaneous+excitation+in+smooth+muscle+of+the+guinea-pig+urinary+bladder.">Origin and propagation of spontaneous excitation in smooth muscle of the guinea-pig urinary bladder.</a> J Physiol. 150, 273-286 (2001).</li><li>Heppner, T. J., Bonev, A. D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elementary+purinergic+Ca2++transients+evoked+by+nerve+stimulation+in+rat+urinary+bladder+smooth+muscle.">Elementary purinergic Ca2+ transients evoked by nerve stimulation in rat urinary bladder smooth muscle.</a> J. Physiol. 564, 201-212 (2005).</li><li>Brain, K. L., Jackson, V. M., Trout, S. J., Cunnane, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermittent+ATP+release+from+nerve+terminals+elicits+focal+smooth+muscle+Ca2++transients+in+mouse+vas+deferens.">Intermittent ATP release from nerve terminals elicits focal smooth muscle Ca2+ transients in mouse vas deferens.</a> J. Physiol. 541, 849-862 (2002).</li><li>Fleichman, M., Schneider, T., Fetscher, C., Michel, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+underlying+carbachol-induced+contraction+of+rat+urinary+bladder+II.+Protein+kinases.">Signal transduction underlying carbachol-induced contraction of rat urinary bladder II. Protein kinases.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 308, 54-58 (2004).</li><li>Young, J. S., Meng, E., Cunnane, T. C., Brain, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+purinergic+neurotransmission+in+the+mouse+urinary+bladder.">Spontaneous purinergic neurotransmission in the mouse urinary bladder.</a> J. Physiol. 586, 5743-5755 (2008).</li><li>Nelson, M. T., Cheng, H., Rubart, M., Santana, L. F., Bonev, A. D., Knot, H. J., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relaxation+of+arterial+smooth+muscle+by+calcium+sparks.">Relaxation of arterial smooth muscle by calcium sparks.</a> Science. 270, 633-637 (1995).</li><li>Th&#233;venaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Trans. Image Process. 7, 27-41 (1998).</li></ol>

Se hicieron esfuerzos para reducir al mínimo el número de animales utilizados y su sufrimiento, todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con el Reino Unido Animales (Procedimientos Científicos) de 1986 y las Comunidades Europeas la Directiva del Consejo 86/09/EEC.

Elección de los fluorescentes Ca 2 + indicador Oregon Green 488 BAPTA-1 AM fue elegido como el Ca 2 + indicador debido a que (i) es brillante en comparación con otros indicadores (por ejemplo, Fluo-4 y el verde de calcio) 1, (ii) es sensible a los cambios fisiológicos en la concentración de Ca2 + con una K d de una magnitud similar a la intracelular de Ca 2 + la concentración de [Ca 2 +] i (por ejemplo, de los conductos deferentes 2), (iii) las cargas de muchas células de músculo liso, permitiendo a las células musculares lisas de acoplamiento a ser monitoreados. Sin embargo, Oregon Green 488 BAPTA-1 AM es una organización no ratioable Ca 2 + indicador, y como tal no puede ser fácilmente utilizada para determinar la absoluta [Ca 2 +] i. Además, también pueden proteger a Ca 2 + si está presente en altas concentraciones y se satura con los cambios de gran amplitud en la [Ca2 +] i. La inhibición de la contractilidad espontánea La contractilidad espontánea de los órganos del músculo liso se puede reducir farmacológicamente, por ejemplo, bloquear el movimiento de Ca 2 + a través de tipo L de Ca 2 + canales (por ejemplo: la nifedipina 3; diltiazem 4). Tenga en cuenta que estas drogas en gran medida reducir la amplitud de su conjunto de células Ca 2 + flashes / transitorios. La contracción de los vasos deferentes resultado de una combinación de la neurotransmisión principalmente purinérgicos y noradrenérgicos. Focal de Ca 2 + transitorios en este tejido, sin embargo, insensible a bloqueo de los receptores noradrenérgicos (por ejemplo, α 1 adrenérgicos, por prazosina 5) lo que el movimiento puede reducirse sin afectar focal Ca 2 + transitorios. Por otra parte, la contracción se puede prevenir &quot;aguas abajo&quot; a través de la inhibición de la quinasa por ejemplo, la cadena ligera de la miosina por wortmanina 6. Conclusiones Monitoreo Ca 2 + de fluorescencia en submicron resolución es una poderosa técnica para estudiar los efectos post-unión de la liberación de neurotransmisores 5,7 y la liberación de Ca 2 + de los almacenes internos (por ejemplo, &#39;chispas&#39; 8). El análisis de los transitorios de Ca 2 + utilizando la metodología descrita aquí es rentable en comparación con los paquetes disponibles en el mercado de análisis de imagen y permite a la medida a través de un análisis personalizado por escrito plugins de Java para ImageJ.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Oregon Green 488 BAPTA-1 AM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>O6807</td>
<td>10 x 50 &mu;g</td>
</tr>
<tr>
<td>Pluronic F-127 solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P3000MP</td>
<td>20% solution in DMSO</td>
</tr>
<tr>
<td>Leica SP2 upright confocal microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Air table (&#x2018;vibration isolated workstation&#x2019;)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Newport</td>
<td>M-VW-3046-OPT-012140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sylgard 184 elastomer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

focal ca2+ transient detection in smooth muscle

Ca 2 + imágenes del músculo liso proporciona información sobre los mecanismos celulares que no pueden dar lugar a cambios del potencial de membrana, tales como la liberación de Ca 2 + de los almacenes internos, y permite a las células múltiples a controlar al mismo tiempo para evaluar, por ejemplo, el acoplamiento en tejido sincitial. Subcelular Ca 2 + transitorios son comunes en el músculo liso, sin embargo, son difíciles de medir con precisión la causa de los problemas causados ​​por su aparición estocástica, sobre un campo amplio de visión con frecuencia, en un órgano que lo hace propenso a contrato. Para superar este problema, hemos desarrollado una serie de protocolos y rutinas de análisis de imágenes para adquirir y analizar, de forma automatizada, la frecuencia, ubicación y amplitud de tales eventos. Si bien este método puede ser aplicado en otros contextos, nuestro trabajo consiste en detectar los locales de Ca 2 + purinérgicos transitorios para la localización de la liberación del transmisor, con resolución sub-micrométricas. ATP se libera como cotransmitter de los nervios autonómicos, donde se une a los receptores P2X1 en el músculo liso del detrusor y los vasos deferentes. Ca 2 + entra en el músculo liso, resultando en purinérgicos neuroefectoras Ca 2 + transitorios (NCTS). El centro de Ca 2 + transitorios permite la monitorización óptica de la liberación de neurotransmisores de una manera que tiene muchas ventajas sobre la electrofisiología. Aparte de la resolución espacial mejorado en gran medida, de grabación óptica tiene la ventaja adicional de permitir la grabación de la liberación del transmisor de muchos sitios de distinguir de forma simultánea. Además, el plano óptico de enfoque es más fácil de mantener o corregir durante la grabación de series de tiempo es el reposicionamiento de un microelectrodo intracelular aguda. En resumen, un método para obtener imágenes de Ca 2 + de fluorescencia se describe que los detalles de la preparación del tejido, y la adquisición y análisis de datos. Planteamos el uso de varios guiones para el análisis de tales Ca 2 + transitorios.

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Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Detalles de los métodos de alta resolución de Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Imágenes del músculo liso en órganos aislados, incluyendo: la preparación de la adquisición de imágenes de tejido y análisis de datos.

Focal Ca 2 + Detección de transitorios en el músculo liso

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ ...

focal-ca2-transient-detection-in-smooth-muscle

Research

JoVE Journal

Biology

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

11.2K vistas.  University of Oxford. Detalles de los métodos de alta resolución de Ca 2 + Imágenes del músculo liso en órganos aislados, incluyendo: la preparación de la adquisición de imágenes de tejido y análisis de datos.

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Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded and their collection does not imply any added risk to the newborn or mother s health. Moreover no ethical concerns are raised. The UC is composed by one vein and two arteries from which both endothelial cells (ECs) 1 and smooth muscle cells (SMCs) 2, two of the main cellular components of blood vessels, can be isolated. In this project the SMCs were obtained after enzymatic treatment of the UC arteries accordingly the experimental procedure previously described by Jaffe et al 3. After cell isolation they were kept in t-flash with DMEM-F12 supplemented with 5% of fetal bovine serum and were cultured for several passages. Cells maintained their morphological and other phenotypic characteristics in the different generations. The aim of this study was to isolate smooth muscle cells in order to use them as models for future assays with constrictor drugs, isolate and structurally characterize L-type calcium channels, to study cellular and molecular aspects of the vascular function 4 and to use them in tissue engineering.

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

The umbilical cords are used to isolate smooth muscle cells by different ways. In this work we used the enzymatic treatment to isolated smooth muscle cells.

El aislamiento de los Derechos Humanos de la arteria umbilical células musculares lisas (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

Investigación

Biología

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in live cells. Here we describe the method used in our laboratories for loading suspensions of human sperm with Ca2+-reporting dyes and measuring the fluorescence signal during physiological stimulation. Motile cells are isolated by direct swim-up and incubated under capacitating conditions for 0-24 h, depending upon the experiment. The cell-permeant AM (acetoxy methyl ester) ester form of the Ca2+-reporting dye is then added to a cell aliquot and a period of 1 h is allowed for loading of the dye into the cytoplasm. We use visible wavelength dyes to minimize photo-damage to the cells, but this means that ratiometric recording is not possible. Advantages and disadvantages of this approach are discussed. During the loading period cells are introduced into an imaging chamber and allowed to adhere to a poly-D-lysine coated coverslip. At the end of the loading period excess dye and loose cells are removed by connection of the chamber to the perfusion apparatus. The chamber is perfused continuously, stimuli and modified salines are then added to the perfusion header. Experiments are recorded by time-lapse acquisition of fluorescence images and analyzed in detail offline, by manually drawing regions of interest. Data are normalized to pre-stimulus levels such that, for each cell (or part of a cell), a graph showing the Ca2+ response as % change in fluorescence is obtained.

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Stimulus-evoked [Ca2+]i signals of individual human sperm are assessed. Motile cells are loaded with Ca2+-sensitive fluorescent dye (AM-ester method) and immobilised in a perfusable chamber. Cells are imaged by time-lapse fluorescence microscopy and stimulated via the perfusing medium. Responses of single cells (or regions) are analysed offline using Excel.

Técnicas de Imagen Ca 2 + Señalización en el esperma humano

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

Contraction or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries determines the artery diameter and thereby controls flow of blood through the vessel and contributes to systemic blood pressure. The contraction process is regulated primarily by cytosolic calcium concentration ([Ca2+]cyt), which is in turn controlled by a variety of ion transporters and channels. Ion channels are common intermediates in signal transduction pathways activated by vasoactive hormones to effect vasoconstriction or vasodilation. And ion channels are often targeted by therapeutic agents either intentionally (e.g. calcium channel blockers used to induce vasodilation and lower blood pressure) or unintentionally (e.g. to induce unwanted cardiovascular side effects).
Kv7 (KCNQ) voltage-activated potassium channels have recently been implicated as important physiological and therapeutic targets for regulation of smooth muscle contraction. To elucidate the specific roles of Kv7 channels in both physiological signal transduction and in the actions of therapeutic agents, we need to study how their activity is modulated at the cellular level as well as evaluate their contribution in the context of the intact artery.
The rat mesenteric arteries provide a useful model system. The arteries can be easily dissected, cleaned of connective tissue, and used to prepare isolated arterial myocytes for patch clamp electrophysiology, or cannulated and pressurized for measurements of vasoconstrictor/vasodilator responses under relatively physiological conditions. Here we describe the methods used for both types of measurements and provide some examples of how the experimental design can be integrated to provide a clearer understanding of the roles of these ion channels in the regulation of vascular tone.

Measurements of Kv7 (KCNQ) potassium channel activity in isolated arterial myocytes (using patch clamp electrophysiological techniques) in parallel with measurements of constrictor/dilator responses (using pressure myography) can reveal important information about the roles of Kv7 channels in vascular smooth muscle physiology and pharmacology.

Exploración del músculo liso arterial KV7 función del canal de potasio mediante electrofisiología Patch Clamp y miografía presión

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling pathways involved in vascular smooth muscle contraction in PASMC from fetal sheep. While sheep make an excellent model of term pulmonary hypertension, they are very expensive and lack the advantage of genetic manipulation found in mice. Conversely, the inability to isolate PASMC from mice was a significant limitation of that system. Here we described the isolation of primary cultures of mouse PASMC from P7, P14, and P21 mice using a variation of the previously described technique of Marshall et al.26 that was previously used to isolate rat PASMC. These murine PASMC represent a novel tool for the study of signaling pathways in the neonatal period. Briefly, a slurry of 0.5% (w/v) agarose + 0.5% iron particles in M199 media is infused into the pulmonary vascular bed via the right ventricle (RV). The iron particles are 0.2 &#956;M in diameter and cannot pass through the pulmonary capillary bed. Thus, the iron lodges in the small pulmonary arteries (PA). The lungs are inflated with agarose, removed and dissociated. The iron-containing vessels are pulled down with a magnet. After collagenase (80 U/ml) treatment and further dissociation, the vessels are put into a tissue culture dish in M199 media containing 20% fetal bovine serum (FBS), and antibiotics (M199 complete media) to allow cell migration onto the culture dish. This initial plate of cells is a 50-50 mixture of fibroblasts and PASMC. Thus, the pull down procedure is repeated multiple times to achieve a more pure PASMC population and remove any residual iron. Smooth muscle cell identity is confirmed by immunostaining for smooth muscle myosin and desmin.

We have developed a novel and reproducible technique to isolate primary cultures of pulmonary artery smooth muscle cells (PASMC) from mice as young as P7, thereby allowing better study of the signaling pathways involved in neonatal smooth muscle cell contraction and relaxation.

El aislamiento de la arteria pulmonar células musculares lisas de los ratones recién nacidos

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ imaging data is time consuming and subject to bias. Automated signal analysis algorithms based on region of interest (ROI) detection have been implemented for one-dimensional line scan measurements, but there is no current algorithm which integrates optimized identification and analysis of ROIs in two-dimensional image sequences. Here an algorithm for rapid acquisition and analysis of ROIs in image sequences is described. It utilizes ellipses fit to noise filtered signals in order to determine optimal ROI placement, and computes Ca2+ signal parameters of amplitude, duration and spatial spread. This algorithm was implemented as a freely available plugin for ImageJ (NIH) software. Together with analysis scripts written for the open source statistical processing software R, this approach provides a high-capacity pipeline for performing quick statistical analysis of experimental output. The authors suggest that use of this analysis protocol will lead to a more complete and unbiased characterization of physiologic Ca2+ signaling.

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Here a novel region of interest analysis protocol based on sorting best-fit ellipses assigned to regions of positive signal within two-dimensional time lapse image sequences is demonstrated. This algorithm may enable investigators to comprehensively analyze physiological Ca2+ signals with minimal user input and bias.

Análisis automatizado de Dinámica Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Las señales en secuencias de imágenes

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues. While this technique has been implemented for over 100 years, the versatility, simplicity and reproducibility of this assay helps it to remain an indispensable tool for pharmacologists and physiologists alike. Tissue bath systems are available in a wide array of shapes and sizes, allowing a scientist to evaluate samples as small as murine mesenteric arteries and as large as porcine ileum &#8211; if not larger. Central to the isolated tissue bath assay is the ability to measure concentration-dependent changes to isometric contraction, and how the efficacy and potency of contractile agonists can be manipulated by increasing concentrations of antagonists or inhibitors. Even though the general principles remain relatively similar, recent technological advances allow even more versatility to the tissue bath assay by incorporating computer-based data recording and analysis software. This video will demonstrate the function of the isolated tissue bath to measure the isometric contraction of an isolated smooth muscle (in this case rat thoracic aorta rings), and share the types of knowledge that can be created with this technique. Included are detailed descriptions of aortic tissue dissection and preparation, placement of aortic rings in the tissue bath and proper tissue equilibration prior to experimentation, tests of tissue viability, experimental design and implementation, and data quantitation. Aorta will be connected to isometric force transducers, the data from which will be captured using a commercially available analog-to-digital converter and bridge amplifier specifically designed for use in these experiments. The accompanying software to this system will be used to visualize the experiment and analyze captured data.

This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition.

La medición de la función del músculo liso en el tejido aislado Bath-aplicaciones en Farmacología Investigación

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on changes in intracellular calcium ([Ca2+]i) and nitric oxide (NO). In order to understand how [Ca2+]i, NO and downstream molecules are handled by a blood vessel in response to vasoconstrictors and vasodilators, we developed a novel technique that applies calcium-labeling (or NO-labeling) dyes with two photon microscopy to measure calcium handling (or NO production) in isolated blood vessels. Described here is a detailed step-by-step procedure that demonstrates how to isolate an aorta from a rat, label calcium or NO within the endothelial or smooth muscle cells, and image calcium transients (or NO production) using a two photon microscope following physiological or pharmacological stimuli. The benefits of using the method are multi-fold: 1) it is possible to simultaneously measure calcium transients in both endothelial cells and smooth muscle cells in response to different stimuli; 2) it allows one to image endothelial cells and smooth muscle cells in their native setting; 3) this method is very sensitive to intracellular calcium or NO changes and generates high resolution images for precise measurements; and 4) described approach can be applied to the measurement of other molecules, such as reactive oxygen species. In summary, application of two photon laser emission microscopy to monitor calcium transients and NO production in the endothelial and smooth muscle cells of an isolated blood vessel has provided high quality quantitative data and promoted our understanding of the mechanisms regulating vascular function.

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta.

De dos fotones de imágenes de Ca intracelular<sup&gt; 2 +</sup&gt; Manejo y producción de óxido nítrico en el endotelio y las células del músculo liso de la aorta de rata aislada

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall health. A significant portion of intracellular Ca2+ content is found within the SR stores in VSMCs. As the only intracellular organelle with a close association to the surrounding extracellular space through plasma membrane-SR junctions, the SR can be considered to constitute the first line of response to any irregularity in Ca2+ transients, or stress experienced by the cell. Among its many functions, one of the most important is its role in the transmission of Ca2+-regulated signals throughout the cell to induce further cell-wide reactions downstream. The more common use of cytoplasmic Ca2+ indicators in this regard is overall insufficient for research into the highly dynamic changes to the intraluminal SR Ca2+ store that have yet to be fully characterized. Here, we provide a detailed protocol for the direct and clear measurement of luminal SR Ca2+. This tool is useful for investigation into the nuanced changes in SR Ca2+ that have significant subsequent effects on the normal function and health of the cell. Fluctuations in SR Ca2+ content specifically can provide us with a significant amount of information pertaining to cellular responses to disease or stress conditions experienced by the cell. In this method, a modified version of a SR-targeted Ca2+ indicator, D1SR, is used to detect Ca2+ fluctuations in response to the introduction of agents to cultured rat aortic smooth muscle cells (SMCs). Following incubation with the D1SR indicator, confocal fluorescence microscopy and fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based imaging are used to directly observe changes to intraluminal SR Ca2+ levels under control conditions and with the addition of agonist agents that function to induce intracellular Ca2+ movement.

Currently, most available calcium indicators are used to quantify cytoplasmic calcium transients as indirect measures of calcium released from the sarcoplasmic reticulum in cultured smooth muscle cells. This protocol describes the use of a specific FRET-based indicator that allows direct measurement of calcium signals within the sarcoplasmic reticulum lumen.

De imagen confocal de medición de las fluctuaciones de calcio en el retículo sarcoplásmico de células musculares lisas cultivadas Uso de FRET a base de

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs from the coronary circulation. Hearts with intact aortic arches were removed and perfused via retrograde Langendorff with digestion solution containing 300 Units/ml of collagenase type II, 0.1 mg/ml soybean trypsin inhibitor and 1 M CaCl2. The perfusates were collected at 15 min intervals for 90 min, pelleted by centrifugation, resuspended in plating media, and plated on tissue culture dishes. VSMCs were characterized by presence of SM22&#945;, &#945;-SMA, and vimentin. One of the main advantages of using this technique is the ability to isolate VSMCs from the coronary circulation of mice. Although the small number of cells obtained can limit some of the applications for which the cells can be utilized, isolated coronary VSMCs can be used in a variety of well-established cell culture techniques and assays. Studies investigating VSMCs from genetically modified mice can provide further information about structure-function and signaling processes associated with vascular pathologies.

The purpose of this protocol is to demonstrate the isolation and culture techniques of murine primary vascular smooth muscle cells (VSMCs) from the coronary circulation. Once VSMCs have been isolated, they can be used for many standard culture techniques.

Aislamiento de murino coronaria células musculares lisas vasculares

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Arterial reconstruction, whether angioplasty or bypass surgery, involves iatrogenic trauma causing endothelial disruption and vascular smooth muscle cell (VSMC) proliferation. Common murine models study small vessels such as the carotid and femoral arteries. Herein we describe an in vivo system in which both VSMC proliferation and endothelial barrier function can be simultaneously assessed in a large vessel. We studied the infrarenal aortic response to injury in C57BL/6 mice. The aorta was injured from the left renal vein to the aortic bifurcation by 30 transmural crushes of 5-seconds duration with a cotton-tipped applicator. Morphological changes were assessed with conventional histology. Aorta wall thickness was measured from the luminal surface to the adventitia. EdU integration and counter staining with DAPI and alpha-actin was used to demonstrate VSMC proliferation. Activation of ERK1/2, a known moderator of intimal hyperplasia formation, was determined by Western Blot analysis. The effect of inflammation was determined by immunohistochemistry for B-cells, T-cells, and macrophages. En face sections of endothelium were visualized with scanning electron microscopy (SEM). Endothelial barrier function was determined with Evans Blue staining. Transmural injury resulted in aortic wall thickening. This injury induced VSMC proliferation, most prominently at 3 days after injury, and early activation of ERK1/2 and decreased p27kip1 expression. Injury did not result in increased B-cells, T-cells, or macrophages infiltration in the vessel wall. Injury caused partial endothelial cell denudation and loss of cell-cell contact. Injury resulted in a significant loss of endothelial barrier function, which returned to baseline after seven days. The murine transmural blunt aortic injury model provides an efficient system to simultaneously study both VSMC proliferation and endothelial barrier function in a large vessel.

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Restenosis following cardiovascular procedures (bypass surgery, angioplasty, or stenting) is a significant problem reducing the durability of these procedures. An ideal therapy would inhibit smooth muscle cell (VSMC) proliferation while promoting regeneration of the endothelium. We describe a model for simultaneous assessment of VSMC proliferation and endothelial function in vivo.

Lesión por aplastamiento aórtico murino: una eficacia<em&gt; In Vivo</em&gt; Modelo de proliferación de células musculares lisas y función endotelial

Arterial reconstruction, whether angioplasty or bypass surgery, involves iatrogenic trauma causing endothelial disruption and vascular smooth muscle cell ...

Focal Ca^{2 +} Detección de transitorios en el músculo liso

Resumen

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Capítulos en este video

El aislamiento de los Derechos Humanos de la arteria umbilical células musculares lisas (HUASMC)

Técnicas de Imagen Ca^{2 +} Señalización en el esperma humano

Exploración del músculo liso arterial KV7 función del canal de potasio mediante electrofisiología Patch Clamp y miografía presión

El aislamiento de la arteria pulmonar células musculares lisas de los ratones recién nacidos

Análisis automatizado de Dinámica Ca

La medición de la función del músculo liso en el tejido aislado Bath-aplicaciones en Farmacología Investigación

De dos fotones de imágenes de Ca intracelular

De imagen confocal de medición de las fluctuaciones de calcio en el retículo sarcoplásmico de células musculares lisas cultivadas Uso de FRET a base de

Aislamiento de murino coronaria células musculares lisas vasculares

Lesión por aplastamiento aórtico murino: una eficacia