Protokol, canlı hücrelerdeki mitokondriyal nükleoidlerin özel etiketlemesine ve yüksek çözünürlükte hareketlerinin nicel çalışmasına izin verir. Floresan boya ile kuluçka sadece ifade üzerinde floresan protein ihtiyacını atlar, ilgili eserler ve sınırlamalar kaçınarak ve non transfectable hücrelere uygulanmasıiçin protokolizin izin. Tercihli nükleoid boyama elde etmek için, bir SYBR Altın ve biz optimize edilmiş koşullar altında başka bir şey kullanmanız gerekir.
Aksi takdirde, toplam hücresel DNA lekeli olabilir. Etiketleme işleminden bir gün önce, kültür dört kez 10'dan beşinci HeLa hücrelerine kadar 35 milimetrelik bir Petri kabında iki mililitre lik orta alanda. Ertesi sabah, bir mililitre fenol kırmızısı serbest kültür ortamı ve uygun 2X etiketleme çözeltisinin bir mililitresini eklemeden önce hücreleri iki mililitre PBS'de yıkayın.
37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit 30 dakika sonra, dikkatle her 35 milimetrelik Petri çanak supernatant içeren boya aspire ve PBS iki mililitre ile hücreleri yıkayın. Sonra taze fenol kırmızı serbest hücre kültürü orta hücreleri beslemek ve canlı görüntüleme kadar ışıktan korunan hücre kültürü kuluçka için kültür dönmek. Canlı hücre görüntülemesi için, görüntüleme seansından en az bir saat önce, sahne üst inkübatörünü süper çözünürlüklü yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu aşamasına yerleştirin ve sıcaklığı 37 dereceye, karbondioksit konsantrasyonunu lazerler de dahil olmak üzere mikroskobun tüm bileşenlerini %5'e ayarlayın ve mikroskop üreticisi tarafından önerilen süper çözünürlüklü aydınlatma mikroskobu için tavsiye edilen yüksek büyütme, yüksek sayısal diyafram daldırma hedefini seçin.
Lazerler ısındığında, mikroskop aşamasına 35 milimetrelik Petri kabını yerleştirin ve kabın dibine bağlı hücrelerle ilgi çeken bir alanı bulmak için oküler kullanın. Süper çözünürlüklü yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu görüntüleri elde etmek için, bir arka uç yüksek uç elektron çarpma yükü birleştirilmiş cihaz kamera kullanın. Görüntü edinme yazılımında, kamera için tavsiye edilen yüksek elektron çarpma kazancı ayarlayın.
Nükleoid izleme için zaman atlamalı seri elde etmeden önce, mitokondriyal boyama için bir kanalda aynı görüş alanının iki renkli süper çözünürlüklü yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu görüntüsünü ve SYBR altın için başka bir görüntü elde edin. Mitokondriyal görüntü renk kanalını kullanılan mitokondriyal leke için uygun uyarma ve emisyona ayarlayın ve SYBR altın boyası için uygun uyarma ve bang Pass emisyon filtresini ayarlayın. Her iki kanal için de mümkün olan en düşük lazer gücünü ayarlayın.
Mikroskop kanalları yalnızca sırayla elde ederse, mitokondriyal leke tespiti için kanalı kapatın. tek bir odak düzlemi edinimi ayarlamak ve mümkün olan en kısa kamera pozlama süresini ayarlamak için Z-stack edinimi kapatmak için yazılımdaki Z-stack kutusunu açın. Izgaranın üç dönüşünü ayarlayın ve kamera pozlama süresinde lazer gücünü optimize etmek için çeşitli lazer güç değerlerinde ve birkaç pozlama süresiyle etiketlenmiş hücrelerin iki boyutlu görüntülerini elde edin.
Mitokondride çok az veya hiç eser içeren parlak noktalara sahip yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu görüntüleri veren lazer gücü ve kamera pozlama sürelerini seçin ve optimize edilmiş ayarları kullanarak zaman atlamalı serinin edinimini başlatın. Zaman atlamalı görüntülerin analizi için, dönüştürülmüş yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu görüntülerini ve nokta izleme modülüne sahip uygun bir görüntü analiz yazılımını açın ve noktalar oluşturma sihirbazını başlatmak için yeni noktalar ekleyin'i tıklatın. Oluştur sekmesinin altında, zaman içinde parça noktalarını tıklatın ve sihirbazın ikinci adımına geçin.
Tahmini x-y çapını 0,1 ila 0,15 mikrometreolarak ayarlayın. Arka plan çıkarma'yı tıklatın ve sihirbazın üçüncü adımına geçin. Nükleotidlerin çoğu her karede nokta tespit edilmedikçe fark edilene kadar kalite filtresieşiğini ayarlamak için histogramdaki dikey çizgiyi sürükleyin.
Sihirbazın dördüncü ve beşinci adımlarına devam edin ve otomatik hareket algoritmasını seçin. Maksimum mesafeyi 0,5 mikrometreye, maksimum boşluk boyutunu sıfıra ayarlayın. İnce ayarlı parametreler yazılımın tüm noktaları algılamasına ve parçaları doğru bir şekilde oluşturmasına izin verdiğinde, parçaların oluşturulmasını onaylamak için şimdi ok düğmesini tıklatın ve parça istatistiklerini ayıklamak için istatistik simgesini tıklatın.
Ardından gerekli istatistik parametrelerini seçin ve sayısallaştırma ve görselleştirme için değerleri nokta CSV dosyaları olarak dışa aktarmak için Kaydet'i tıklatın. SYBR altın veya PicoGreen yüksek konsantrasyonlarda etiketleme çekirdekleri bol boyama ve sitoplazma içinde punctate boyama sonuçları. Daha düşük konsantrasyonlarda, soluk SYBR altın sinyali parlak noktalar bir desen çekirdekleri içinde görünür sitoplazma içinde gözlenir.
Düşük konsantrasyonlarda PicoGreen etiketleme çoğunlukla nükleer boyama verir. Uzak kırmızı mitokondriyal boyada düşük konsantrasyonlarda SYBR altın konsantrasyonları ile eşzamanlı boyama, SYBR altın boyamahemen hemen tüm mitokondri içinde meydana gelir ken yüksek konsantrasyonlarda etiketleme çekirdekleri ve sitoplazma önemli boyama ile sonuçlanır ortaya koymaktadır. Hızlandırılmış görüntüleme 45 dakika sonra nükleoid boyama doygunluğa yakın olduğunu ortaya koymaktadır.
Fiksasyon boyanın çekirdeğe hafif çehresine yeniden dağıtılmasına neden olurken, sabit hücrelerin permeblizasyonu mitokondrinin noktalı boyama desenini ortadan kaldırır ve nükleer boyamayı artırır. Fiksasyon ve permeablizasyondan sonra hücrelere SYBR altın eklenirse, boya sitoplazma ve çekirdek boyunca düzgün bir şekilde dağılır ve lekelenme özgüllüğünün kaybına neden olur. Süper çözünürlüklü yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu ile canlı hücre 3D görüntüleme mitokondriyal nükleoid mitokondri içinde parlak noktalar olarak ortaya koymaktadır.
Nükleoidin kırınım limitinin ötesinde bir çözünürlükte konumlarının izlenmesi, nükleoidlerin çoğunun muhtemelen mitokondriyal ağla sınırlı olan kısa mesafeli rastgele hareketler gösterdiğini göstermektedir. Bu protokolün numunenin fiksasyonuyla uyumlu olmadığını belirtmek önemlidir. Ancak protokolümüz, molekül ve organellerin morfolojisi, dinamiği ve faaliyetleri üzerine çalışma için çok çeşitli canlı hücre görüntüleme temelli tahlillerle uyumlu olmalıdır.
Çalışmamız hücre bazlı teknikler için organik olmayan boyaların yeniden hedeflenin avantajlarını göstermektedir. Bu hücresel çalışmalarda kendi uygulaması için diğer floresan boyalar keşif ilham verebilir.
