O protocolo permite a rotulagem específica de nucleóides mitocondriais em células vivas e o estudo quantitativo de sua moção em alta resolução. A incubação com o corante fluorescente só contorna a necessidade de proteína fluorescente sobre a expressão, evitando artefatos e limitações relacionados e permitindo que nosso protocolo seja aplicado a células não transibrificáveis. Para alcançar a coloração nucleóide preferencial, deve-se usar SYBR Gold e nada mais sob as condições que otimizamos.
Caso contrário, o DNA celular total pode estar manchado. Um dia antes do procedimento de rotulagem, cultura quatro vezes 10 para a quinta células HeLa em dois mililitros de médio em uma placa de Petri de 35 milímetros. Na manhã seguinte, lave as células em dois mililitros de PBS antes de adicionar um mililitro de meio de cultura livre de fenol vermelho e um mililitro da solução de rotulagem 2X apropriada.
Após 30 minutos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, aspire cuidadosamente o corante contendo supernanato de cada placa de Petri de 35 milímetros e lave as células com dois mililitros de PBS. Em seguida, alimente as células com meio de cultura celular livre de fenol fresco e devolva a cultura à incubadora de cultura celular protegida da luz até a imagem viva. Para imagens de células vivas, pelo menos uma hora antes da sessão de imagem, coloque a incubadora superior do palco no estágio do microscópio de iluminação estruturada de super resolução e coloque a temperatura em 37 graus Celsius e a concentração de dióxido de carbono em 5% Ligue todos os componentes do microscópio, incluindo os lasers, e selecione uma alta ampliação, objetivo de imersão de alta abertura numérica, conforme recomendado para microcópia estruturada de super resolução pelo fabricante do microscópio.
Quando os lasers tiverem aquecido, instale a placa de Petri de 35 milímetros no estágio do microscópio e use os oculares para localizar uma área de interesse com células presas ao fundo do prato. Para adquirir imagens de microscopia de iluminação estruturada de super resolução, use uma câmera de dispositivo de multiplicação de elétrons high-end de extremidade traseira acoplado. No software de aquisição de imagens, defina um alto ganho de multiplicação de elétrons conforme recomendado para a câmera.
Antes de adquirir a série time lapse para rastreamento nucleóide, adquira uma imagem de microscopia de iluminação estruturada de duas cores do mesmo campo de visão em um canal para coloração mitocondrial e outro para ouro SYBR. Defina o canal de cores de imagem mitocondrial para a excitação e emissão adequadas para a mancha mitocondrial utilizada e defina o filtro de emissão de excitação e bang pass apropriado para o corante de ouro SYBR. Defina a menor potência laser possível para ambos os canais.
Se o microscópio adquirir canais apenas sequencialmente, desligue o canal para a detecção de manchas mitocondriais. untick a caixa Z-stack no software para desligar a aquisição de pilha Z para definir a aquisição de um único plano focal e definir o menor tempo de exposição da câmera possível. Defina três rotações da grade e adquira imagens bidimensionais das células rotuladas a vários valores de potência laser e vários tempos de exposição para otimizar a potência do laser no tempo de exposição da câmera.
Selecione os tempos de exposição de energia a laser e câmera que produzem imagens estruturadas de microscopia de iluminação com pontos brilhantes nas mitocôndrias com pouco ou nenhum artefato e inicie a aquisição da série de lapsos de tempo usando as configurações otimizadas. Para análise das imagens de lapso de tempo, abra as imagens de microscopia de iluminação estruturada convertida e um software apropriado de análise de imagem que tenha um módulo de rastreamento de manchas e clique em adicionar novos pontos para iniciar o assistente de criação de pontos. Na guia criar, clique em rastrear pontos ao longo do tempo e proceda para a segunda etapa do assistente.
Defina o diâmetro x-y estimado para 0,1 a 0,15 micrômetros. Clique em subtração de fundo e prossiga para o terceiro passo no assistente. Arraste a linha vertical no histograma para ajustar o limiar do filtro de qualidade até que a maioria dos nucleotídeos sejam detectados, pois as manchas nos artefatos não são detectadas dentro de cada quadro.
Vá para o quarto e quinto passos do assistente e selecione o algoritmo de movimento autoregressivo. Ajuste a distância máxima para 0,5 micrômetros e o tamanho máximo da abertura a zero. Quando os parâmetros ajustados permitem que o software detecte todos os pontos e construa faixas corretamente, clique no botão seta agora para confirmar a criação das faixas e clique no ícone estatístico para extrair as estatísticas de faixas.
Em seguida, selecione os parâmetros estatísticos necessários e clique em Salvar Como exportar os valores como arquivos de ponto CSV para quantificação e visualização. A rotulagem com altas concentrações de ouro SYBR ou PicoGreen resulta em coloração abundante dos núcleos e coloração pontual dentro do citoplasma. Em concentrações mais baixas, o sinal de ouro SYBR fraco aparece dentro dos núcleos em um padrão de pontos brilhantes é observado dentro do citoplasma.
A rotulagem picogreen em baixas concentrações produz principalmente manchas nucleares. A coloração simultânea com baixas concentrações de ouro SYBR em um corante mitocondrial muito vermelho revela que quase toda a mancha de ouro SYBR ocorre dentro das mitocôndrias enquanto a rotulagem em altas concentrações resulta em manchas significativas dos núcleos e citoplasma. A imagem do Time-Lapse revela que após 45 minutos a coloração nucleóide está perto da saturação.
A fixação causa uma leve redistribuição do corante para o núcleo, enquanto a permeablização das células fixas elimina o padrão de coloração pontilhada das mitocôndrias e aumenta a coloração nuclear. Se o ouro SYBR é adicionado às células após fixação e permeablização, então o corante é distribuído uniformemente através do citoplasma e do núcleo resultando na perda da especificidade da coloração. Imagens 3D de células vivas por microscópio de iluminação estruturada de super resolução revelam o nucleóide mitocondrial como pontos brilhantes dentro das mitocôndrias.
Rastrear as posições do nucleóide em uma resolução além do limite de difração demonstra que a maioria dos nucleóides apresentam movimentos aleatórios de curta distância que provavelmente estão confinados à rede mitocondrial. É importante notar que este protocolo não é compatível com a fixação da amostra. No entanto, nosso protocolo deve ser compatível com uma ampla gama de ensaios baseados em imagens de células vivas para estudo de morfologia, dinâmica e atividades de moléculas e organelas.
Nosso estudo ilustra as vantagens de redirecionar corantes não orgânicos para técnicas baseadas em células. Pode inspirar a exploração de outros corantes fluorescentes para sua aplicação em estudos celulares.
