このプロトコルは、生細胞におけるミトコンドリアヌクレオイドの特異的標識と、その運動の高分解能における定量的研究を可能にする。蛍光色素によるインキュベーションは、蛍光タンパク質の必要性をバイパスするだけで、関連するアーティファクトや制限を回避し、トランスフェクト不可能な細胞にプロトコルを適用することができます。優等核の染色を達成するためには、SYBR Goldを使用し、最適化した条件下では何も使用しないでください。
さもなければ、全細胞DNAが染色され得る。ラベリング手順の1日前に、35ミリメートルペトリ皿中の培地2ミリリットルで5番目のHeLa細胞に10回10回培養する。翌朝、2ミリリットルのPBSで細胞を洗浄してから、フェノール赤自由培養液1ミリリットルと適切な2Xラベリング溶液の1ミリリットルを添加する。
30分37度と5%の二酸化炭素で、上清を含む色素を各35ミリメートルのペトリ皿から慎重に吸引し、2ミリリットルのPBSで細胞を洗います。次に、新鮮なフェノール赤自由細胞培養培地で細胞を供給し、生きたイメージングまで光から保護された培養インキュベーターに培養液を戻す。ライブセルイメージングの場合、イメージングセッションの少なくとも1時間前に、ステージトップインキュベーターを超解像度の構造照明顕微鏡ステージに配置し、レーザーを含む顕微鏡のすべてのコンポーネントの温度を摂氏37度に、二酸化炭素濃度を5%スイッチに設定し、高倍率、高数値開腹浸漬目的を選択します。
レーザーが温まったら、35ミリメートルのペトリ皿を顕微鏡のステージに取り付け、眼を使って皿の底に取り付けられた細胞で関心のある領域を見つけます。超解像度の構造化照明顕微鏡画像を取得するには、バックエンドハイエンド電子乗算電荷結合デバイスカメラを使用します。画像取得ソフトウェアでは、カメラに推奨される高電子乗算ゲインを設定します。
ヌクレオイド追跡用のタイムラプスシリーズを取得する前に、ミトコンドリア染色用の1つのチャネルとSYBR金用の別のチャネルで同じ視野の2色超解像度の構造化照明顕微鏡画像を取得します。ミトコンドリア画像カラーチャネルを、使用するミトコンドリア染色に適した励起と放出に設定し、SYBRゴールド色素に適した励起およびバンパスエミッションフィルタを設定します。両方のチャンネルに可能な限り低いレーザーパワーを設定します。
顕微鏡が連続的にチャンネルを取得する場合は、ミトコンドリア染色検出用のチャネルをオフにします。ソフトウェアの Z スタック ボックスのチェックを外して、Z スタックの取得をオフにして単一の焦点面の取得を設定し、カメラの露出時間を最短に設定します。グリッドの3回転を設定し、複数のレーザーパワー値と数回の露出時間でラベル付けされたセルの2次元画像を取得し、カメラの露出時間にレーザーパワーを最適化します。
ほとんどまたは全くアーティファクトを持つミトコンドリアの明るいスポットを持つ構造化された照明顕微鏡画像を生成するレーザーパワーとカメラの露出時間を選択し、最適化された設定を使用してタイムラプスシリーズの取得を開始します。タイムラプス画像の解析のために、変換された構造化照明顕微鏡画像とスポットトラッキングモジュールを備えた適切な画像解析ソフトウェアを開き、[新しいスポットを追加]をクリックしてスポット作成ウィザードを開始します。[作成] タブで[時間の経過に従ってスポットを追跡]をクリックし、ウィザードの 2 番目の手順に進みます。
推定 x-y 直径を 0.1 ~ 0.15 マイクロメートルに設定します。[背景の減算] をクリックし、ウィザードの 3 番目の手順に進みます。ヒストグラムの垂直線をドラッグして、各フレーム内でアーチファクト内のスポットが検出されないとき、大部分のヌクレオチドが検出されるまで、品質フィルタの閾値を調整します。
ウィザードの 4 番目と 5 番目の手順に進み、自己回帰モーション アルゴリズムを選択します。最大距離を 0.5 マイクロメートルに、最大ギャップ サイズをゼロに設定します。微調整されたパラメーターにより、ソフトウェアがすべてのスポットを検出してトラックを正しく作成できる場合は、矢印ボタンをクリックしてトラックの作成を確認し、統計情報アイコンをクリックしてトラックの統計情報を抽出します。
次に、必要な統計情報パラメータを選択し、[名前を付けて保存]をクリックして、値をドット CSV ファイルとしてエクスポートして定量化と視覚化を行います。SYBR金またはピコグリーンの高濃度で標識すると、核の豊富な染色と細胞質内の穿刺染色が生じます。より低い濃度では、細胞質内で明るいスポットのパターンで核内にかすかなSYBR金シグナルが現れる。
低濃度でのピコグリーン標識は、主に核染色をもたらす。遠赤色ミトコンドリア色素中のSYBR金の低濃度で同時染色すると、SYBR金染色のほとんどすべてがミトコンドリア内で起こり、高濃度で標識すると核および細胞質の有意な染色が生じることが明らかになる。タイムラプスイメージングは、45分後にヌクレオイド染色が飽和に近いことを明らかにします。
固定は、固定細胞の透過化はミトコンドリアの点線染色パターンを排除し、核染色を強化しながら、核への色素のわずかな再分配を引き起こす。SYBR金が固定および透過化後に細胞に添加された場合、色素は細胞質と核全体に均一に分布し、染色特異性の損失をもたらす。超分解能構造照明顕微鏡による生細胞3Dイメージングは、ミトコンドリア内の明るいスポットとしてミトコンドリアヌクレオイドを明らかにする。
回折限界を超える解像度で核の位置を追跡することは、核の大部分がミトコンドリアネットワークに限定される短距離のランダムな動きを示すことを示しています。このプロトコルはサンプルの固定と互換性がないことに注意することが重要です。しかし、我々のプロトコルは、分子およびオルガネラの形態、ダイナミクスおよび活動の研究のための生細胞画像に基づくアッセイの広い範囲と互換性があるべきである。
我々の研究は、細胞ベースの技術のための非有機色素を再標的化することの利点を示している。細胞研究におけるその応用のために他の蛍光色素の探索を促すかもしれない。
