Протокол допускает специфическую маркировку митохондриальных нуклеоидов в живых клетках и количественное изучение их движения с высоким разрешением. Инкубация флуоресцентным красителем только обходит потребность в флуоресцентном белке над экспрессией, избегая связанных с этим артефактов и ограничений и позволяя применять наш протокол к не трансинфекциоемым клеткам. Для достижения преференциального нуклеоидного окрашивания следует использовать SYBR Gold и ничего больше в условиях, которые мы оптимизировали.
В противном случае, общая клеточная ДНК может быть окрашена. За день до процедуры маркировки культура четыре раза от 10 до пятой клетки HeLa в двух миллилитров среды в 35-миллиметровой чашке Петри. На следующее утро, мыть клетки в двух миллилитров PBS, прежде чем добавить один миллилитр фенола красный свободной среды культуры и один миллилитр соответствующего решения 2X маркировки.
Через 30 минут при 37 градусах Цельсия и 5%углекислом газе тщательно аспирировать краситель, содержащий супернатант из каждой 35-миллиметровой чашки Петри и промыть клетки двумя миллилитров PBS. Затем кормить клетки свежим фенол красный свободной среды культуры клеток и вернуть культуру в инкубатор клеточной культуры защищены от света до живой визуализации. Для живой визуализации клеток, по крайней мере за час до сеанса визуализации, поместите верхний инкубатор сцены на этап структурированного светового микроскопа супер разрешения и установите температуру до 37 градусов по Цельсию и концентрацию углекислого газа до 5%Включите все компоненты микроскопа, включая лазеры, и выберите высокое увеличение, высокую цель погружения в числовую диафрагму, как это рекомендовано для микроскопии освещения super resolution, структурированной производителем микроскопа.
Когда лазеры разогреются, установите 35-миллиметровую чашку Петри на сцену микроскопа и используйте глазки, чтобы найти область интереса с клетками, прикрепленными к нижней части блюда. Чтобы получить супер разрешение структурированных изображений микроскопии освещения, используйте задний конец высокого конца электрона умножения заряда соединенной камеры устройства. В программном обеспечении для получения изображений установите высокий прирост умножения электронов, как это рекомендовано для камеры.
Прежде чем приобрести серию промежуток времени для отслеживания нуклеоидов, приобрести два цвета супер разрешение структурированной микроскопии изображения того же поля зрения в одном канале для митохондриального окрашивания и еще один для золота SYBR. Установите митохондриальный цветной канал изображения для соответствующего возбуждения и выброса для митохондриального пятна, используемого и установить соответствующее возбуждение и bang Pass фильтр выбросов для красителя золота SYBR. Установите самую низкую мощность лазера для обоих каналов.
Если микроскоп приобретает каналы только последовательно, выключите канал для обнаружения митохондриальных пятен. Отключить коробку с стеком в программном обеспечении, чтобы отключить приобретение q-stack, чтобы установить приобретение одной фокусной плоскости и установить кратчайшее время экспозиции камеры. Установите три вращения сетки и приобретете двумерные изображения помеченных ячеек при нескольких значениях мощности лазера и несколько раз экспозиции для оптимизации мощности лазера во время экспозиции камеры.
Выберите лазерную мощность и время экспозиции камеры, которые дают структурированные изображения микроскопии освещения с яркими пятнами в митохондриях с небольшим или в отсутствие артефактов и начать приобретение промежуток времени серии с использованием оптимизированных параметров. Для анализа изображений промежуток времени, откройте преобразованные структурированные изображения микроскопии освещения и соответствующее программное обеспечение анализа изображений, которое имеет модуль отслеживания пятна и нажмите добавить новые пятна, чтобы начать мастера создания пятен. Под вкладкой создать, нажмите трек пятна с течением времени и перейти к второй шаг мастера.
Установите расчетный диаметр x-y до 0,1-0,15 микрометра. Нажмите на фоновое вычитание и перейти к третьему шагу в мастере. Перетащите вертикальную линию в гистограмме, чтобы отрегулировать порог фильтра качества до тех пор, пока большинство нуклеотидов не будет обнаружено, поскольку пятна в артефактах не обнаруживаются в каждом кадре.
Перейти к четвертой и пятой ступеням мастера и выбрать алгоритм авторегрессивного движения. Установите максимальное расстояние до 0,5 микрометра и максимальный размер разрыва до нуля. Когда тонкие настроенные параметры позволяют программному обеспечению обнаружить все пятна и построить треки правильно, Нажмите кнопку стрелка сейчас, чтобы подтвердить создание треков и нажмите значок статистики, чтобы извлечь статистику треков.
Затем выберите необходимые параметры статистики и нажмите Сохранить Как экспортировать значения, как точка CSV файлы для количественной оценки и визуализации. Маркировка с высокими концентрациями золота SYBR или PicoGreen приводит к обильному окрашивания ядер и пунктуатного окрашивания в цитоплазме. При более низких концентрациях слабый золотой сигнал SYBR появляется в ядрах в структуре ярких пятен, наблюдаемых в цитоплазме.
PicoGreen маркировки при низких концентрациях дает в основном ядерного окрашивания. Одновременное окрашивание с низкой концентрацией золота SYBR в гораздо красном митохондриальном красителе показывает, что почти все окрашивание золота SYBR происходит в митохондриях при маркировке в высоких концентрациях приводит к значительному окрашивание ядер и цитоплазмы. Time-Lapse изображения показывает, что после 45 минут нуклеоидного окрашивания близка к насыщению.
Фиксация вызывает небольшое перераспределение красителя в ядро, в то время как пермяка фиксированных клеток устраняет пунктирную окраску митохондрий и усиливает ядерное окрашивание. Если золото SYBR добавляется в клетки после фиксации и пермяки, то краситель равномерно распределяется по цитоплазме и ядру, что приводит к потере специфичности окрашивания. 3D-изображение живых клеток с помощью структурированного микроскопа освещения супер разрешения показывает митохондриальный нуклеоид как яркие пятна в митохондриях.
Отслеживание положения нуклеоида в разрешении за пределами предела дифракции показывает, что большинство нуклеоидов демонстрируют случайные движения на короткое расстояние, которые, вероятно, ограничены митохондриальной сетью. Важно отметить, что этот протокол не совместим с фиксацией образца. Тем не менее, наш протокол должен быть совместим с широким спектром живых клеток изображений на основе анализов для изучения морфологии, динамики и деятельности молекул и органелл.
Наше исследование иллюстрирует преимущества ретаргетинга неорганических красителей для клеточных методов. Это может вдохновить на исследование других флуоресцентных красителей для их применения в клеточных исследованиях.
