La baja eficiencia de la transfección es un obstáculo importante para determinar cómo la proteína reactiva el crecimiento de la neurita en las neuronas primarias. Nuestro protocolo supera este problema mediante la correfección conjunta de EGFP para identificar con éxito las células trans infectadas. La alta tasa de co-transfección de EGFP y las proteínas de interés aseguran la exactitud del ensayo.
Y en consecuencia, ahora se requiere tinción de inmunofluorescencia. Como el crecimiento de la neurita ocurre durante la regeneración neuronal, este método se puede aplicar a la identificación de nuevos objetivos para restaurar la red neuronal dañada en trauma cerebral o enfermedades neurodegenerativas. Antes de comenzar el procedimiento, coloque un cubreobjetos circulares estéril de 18 milímetros en cada pocódito de una placa de cultivo de tejido de 12 pozos y cubra cada cubrelobjetos con cinco microgramos por milímetro de solución de poli-D-lisina en una incubadora humecida de 37 grados Centígrados durante al menos una hora.
Al final de la incubación, aspirar la solución de poli-D-lisina y enjuagar los cubreobjetos con agua estéril. En el día embrionario 18, coloque el útero cosechado de una rata Sprague Dawley embarazada en una placa Petri de 10 centímetros y use pequeñas tijeras diseccionadas para abrir el útero y el saco amniótico. Utilice las tijeras para extraer la placenta y utilizar fórceps para transferir un embrión entero a un nuevo plato de Petri de 10 centímetros que contenga glucosa PBS refrigerada.
Usa las tijeras para cortar a lo largo de la sutura sagital del cráneo y usa una pequeña espátula plana para transferir el cerebro embrionario a una nueva placa Petri de 10 centímetros que contenga glucosa PBS helada fresca. Usando dos pinzas número cinco y un microscopio de disección, separe los dos hemisferios cerebrales del cerebelo y el tallo cerebral y retire las meninges. A continuación, aísle la corteza de los hemisferios cerebrales y coloque la corteza en un tubo de 15 mililitros que contenga glucosa PBS helada fresca.
Para el cultivo de neuronas corticales primarias, en un gabinete de bioseguridad de clase II, permita que la corteza se asiente por gravedad durante cinco minutos a cuatro grados centígrados antes de reemplazar la glucosa PBS con 0.05%trypsin EDTA. Mezclar con un suave golpeteo e incubar el tejido en un baño de agua de 37 grados Celsius durante 10 minutos con golpeteo suave adicional cada dos minutos. Al final de la incubación, detener la digestión con cuatro mililitros de medio de mantenimiento y utilizar una pipeta de un mililitro para disociar el tejido con una trituración suave.
Sedimentar las células por centrifugación y resuspender el pellet en un mililitro de medio de mantenimiento para una segunda centrifugación. Resuspender el pellet formado después de la segunda centrifugación en un mililitro de medio de mantenimiento fresco para el recuento y placar las neuronas aisladas en una 6,5 veces 10 a las cuartas células viables por centímetro de concentración cuadrada en un mililitro de medio de mantenimiento por pozo en una placa de 12 pozos. Después de dos días a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono, diluir el EGFP y el plásmido proteico objetivo DNA y el reactivo de transfección en dos tubos separados de 1,5 mililitros y luego mezclarlos.
Transfectar las células con la construcción EGFP añadiendo la mezcla de transfección a los pozos. Después de 24 horas, lavar las células con 37 grados Celsius PBS y fijarlas con 4%paraformaldehído en PBS durante 10 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente. Al final de la incubación, lave las células fijas tres veces con PBS fresco por lavado y agregue un volumen mínimo de medio de montaje de fluorescencia en un portaobjetos de vidrio de microscopio por muestra.
A continuación, transfiera cuidadosamente los cubreobjetos recubiertos al soporte de montaje con las muestras orientadas a las diapositivas de vidrio. Para imaginar el crecimiento de neurito, seleccione el objetivo 40X en un microscopio epifluorescente y haga clic en Start para capturar imágenes de al menos 40 neuronas positivas EGFP intactas por transfección. Cuando todas las neuritas hayan sido imagen, abra las imágenes capturadas en ImageJ con el plugin NeuronJ y mida la longitud del neurito más largo de cada neurona desde el cuerpo celular hasta la punta del cono de crecimiento.
A continuación, analice los datos obtenidos con el software para determinar el efecto de las proteínas dirigidas en el crecimiento de la neurita. La citocaplasina D suprime la extensión de la neurita de una manera dependiente de la dosis, mientras que el crecimiento de la neurita se mejora en las neuronas tratadas con factor de crecimiento nervioso. Además, la proteína adaptadora de crecimiento neuronal FE65 estimula significativamente el crecimiento de la neurita dos veces en comparación con las neuronas no traducibles.
A pesar de una baja eficiencia de la transfección, el análisis de inmunofluorescencia revela que más del 80% de un cultivo celular de dos días puede ser co-transfectados con éxito con EGFP y FE65. La expresión EGFP se detecta a las seis horas después de la transfección, mientras que el FE65 se detecta por primera vez en la hora 12 y ambas señales se detectan hasta siete días después de la transfección. La transfección de neuronas corticales de rata primarias con diferentes cantidades de ADN plásmido FE65 revela un aumento dependiente de la dosis en la extensión de neurito con 0 a 0,5 microgramos de plásmido FE65.
Sin embargo, no se observa ninguna diferencia significativa en el crecimiento en las neuronas transfectadas con 0,5 o uno microgramos del plásmido. Al intentar el protocolo, es importante aislar la región apropiada del cerebro embrionario. Esta técnica también se puede aplicar al estudio del crecimiento neuronal en neuronas derivadas de iPSC humanos que tienen herramientas valiosas para la medicina regenerativa.
