Usando nuestro protocolo, podemos visualizar y evaluar cuantitativamente la dinámica de la señalización de endosomas y mitocondrias dentro de los axones de las neuronas motoras y sensoriales de ratones anestesiados vivos. Este método que se puede utilizar para comprender la fisiología basal de los axones in vivo y revelar un importante mecanismo pato-mecanismo que impulsa la neurodegeneración periférica en el modelo de enfermedad del ratón. Nuestra técnica se puede utilizar para evaluar el efecto de posibles tratamientos como agentes farmacológicos y terapias génicas sobre el transporte axonal en neuronas motoras y sensoriales vivas.
Esta técnica se puede utilizar para obtener imágenes simultáneas de diferentes orgánulos en un axón nervioso periférico específico y transmitir el estudio de modelos de enfermedades motoras, así como el envejecimiento. Comience las preparaciones tirando de una micropipeta de vidrio graduada para inyecciones intramusculares óptimas en músculos más pequeños. Para la cirugía, asegure una cortina quirúrgica estéril en una estera térmica a 37 grados centígrados y coloque y enfoque el microscopio operativo.
Luego, desempaque todas las herramientas e instrumentos quirúrgicos requeridos como se describe en el manuscrito. Cuando terminen las preparaciones, transfiera el ratón anestesiado a la boquilla ubicada en un área separada del espacio quirúrgico y asegúrese de que los reflejos de extracción corneal y del pedal estén ausentes antes de afeitar el pelaje del área quirúrgica. Luego, retire el pelaje afeitado del mouse usando el lado pegajoso de la cinta quirúrgica.
A continuación, coloque el ratón en las básculas de pesaje para registrar el peso prequirúrgico. Luego, use un hisopo de algodón para aplicar lubricante para los ojos y transfiera el mouse y la boquilla al área quirúrgica. Para inyectar el tibial anterior, o músculo TA, coloque el ratón en la espalda y estire la extremidad posterior a 10 grados de la línea media.
Cuando la extremidad posterior esté en la posición correcta, coloque una cinta quirúrgica en todo el pie. Esterilizar el área afeitada usando un 70% de etanol o solución equivalente. Extraiga el fragmento atóxico de trabajo de la solución de tétanos, neurotoxina o HcT en una micropipeta de vidrio tirado.
A continuación, haga una pequeña incisión sobre el músculo de interés en el área que corresponde con las regiones motora y de placa. Entonces. perfore la fascia externa en el músculo para inyectar el HcT. Deje la micropipeta en posición durante cinco a 10 segundos antes de retirarla lentamente.
Después de la inyección, cierre las incisiones con uno o dos puntos de sutura. Luego, transfiera el ratón a una jaula de recuperación aislada bajo observación durante 30 minutos. Prepárese para exponer el nervio ciático organizando las herramientas e instrumentos quirúrgicos alrededor del área quirúrgica.
Cree una cuña cortando la parapelícula en un rectángulo estrecho de ancho de un centímetro con una punta en ángulo para ayudar al proceso de obtención de imágenes. Una vez que se hayan realizado las preparaciones, transfiera el mouse a la boquilla en el área quirúrgica y use cinta quirúrgica para asegurar la cabeza a la boquilla. Extienda y asegure la extremidad posterior objetivo a 45 grados desde la línea media con cinta quirúrgica.
Si los reflejos de abstinencia corneal y del pedal están ausentes, corte la piel que recubre el nervio ciático con tijeras. Luego, retire el músculo fémur del bíceps suprayacente y la musculatura o el tejido conectivo sin dañar el nervio ciático y los vasos sanguíneos. Cuando el nervio ciático intacto esté lo suficientemente expuesto, aplique solución salina estéril precalentada en el área alrededor del nervio ciático para evitar la desecación.
Luego, use fórceps curvas para interrumpir el tejido conectivo profundo y coloque la cuña de parapelícula preparada previamente debajo del nervio. Coloque algodón empapado en solución salina en el área expuesta antes de mover el ratón sobre la estera térmica hacia la cámara de inducción llena de isoflurano y oxígeno. Para las imágenes, coloque un vidrio de cubierta de 22 por 64 milímetros en el escenario del microscopio personalizado y asegure la posición del vidrio de la cubierta con una cinta.
Después de aplicar aceite de inmersión al objetivo, conecte la etapa del microscopio al microscopio invertido y eleve lentamente el objetivo sumergido en aceite para que entre en contacto con el vidrio de la cubierta. Cuando la configuración esté lista, asegure la boquilla anestésica en la etapa del microscopio con cinta adhesiva. Luego, retire el algodón del nervio ciático y transfiera el ratón de la cámara de inducción a la boquilla con el nervio expuesto frente al vidrio de la cubierta.
Asegure la cabeza del ratón a la boquilla y, mientras mantiene el nivel adecuado más bajo de anestesia, levante suavemente el ratón por la cola para agregar solución salina estéril al deslizamiento de la cubierta cerca del nervio ciático expuesto. Con la ayuda de los oculares, localice el nervio ciático para determinar el punto focal óptimo y seleccione un área de interés que contenga orgánulos axonales móviles. A continuación, cambie al software de la computadora haciendo clic en el botón Adquisición y seleccionando un área de interés.
Utilice el zoom digital para obtener un aumento de 80 veces y gire el área seleccionada para visualizar los axones horizontalmente Haga clic en el cuadro Regiones y seleccione una región rectangular de interés. En el modo de adquisición, establezca el tamaño del fotograma en un mínimo de 1024 por 1024 píxeles y comience la adquisición de lapso de tiempo de 100 a 1.000 fotogramas. Capture un mínimo de 10 cargas móviles de los tres axones por ratón.
En el estudio, el etiquetado axónico-específico motor in vivo se logró utilizando ratones transgénicos. La proteína de florescencia verde mejorada, o expresión de eGFP, en axones motores colinérgicos se observó a partir de un ChAT vivo y anestesiado. Ratón eGFP.
Con el método alternativo, la expresión de tdTomato en un nervio recién extirpado de un ChAT. tdTomato ratón se logró sin procesamiento de tejido adicional. Además, los axones se identificaron inyectando trazadores o marcadores como HcT o adenovirus que codifican eGFP en los músculos esqueléticos.
El análisis representativo demuestra una serie de imágenes de lapso de tiempo que representan el transporte axonal in vivo de endosomas de señalización en neuronas motoras vivas de una HB9. Ratón GFP. La GFP tuvo un patrón más granular en HB9.
Axones GFP. La cría de Mito. Ratones CFP con ChAT.
Los ratones tdTomato permitieron la visualización de las mitocondrias en los axones motores. Además, también se pudo identificar el Nodo de Ranvier. La inyección de HcT en los músculos del Mito.
Los ratones CFP permitieron la visualización simultánea de endosomas de señalización y mitocondrias dentro de los mismos axones in vivo. Se observaron orgánulos en movimiento anterógrado y retrógrado, así como orgánulos estancados. La reducción de la anestesia durante el proceso de obtención de imágenes es ventajosa porque puede limitar el impacto de los grandes artefactos respiratorios y, por lo tanto, simplificar el seguimiento y el análisis del transporte axonal.
Los nervios ciáticos pueden ser instructivos para el análisis de ARN y proteínas para correlacionar la dinámica de los orgánulos con componentes clave de la maquinaria de transporte axonal, como las proteínas motoras y los adaptadores específicos de la carga.
