En la práctica clínica, su costumbre asumir que cada ócito que muestra un cuerpo polar está listo para la fertilización. Las imágenes de vida de la maduración de ovocitos humanos revelan que un cuerpo polar se hace visible mucho antes de que se ensamble el husillo metafásica II bipolar, creando el riesgo de una inyección de espermatozoides prematura. La microscopía de luz polarizada permite una visualización no invasiva del husillo meiótico en ovocitos humanos, y se puede utilizar con seguridad en IFV para evaluar la madurez del óvulo antes de la inyección intracitoplasmática de espermatozoides.
Optimizar el tiempo del ICSI es particularmente importante en el mal pronóstico de los ciclos de FIV, con un bajo número de ovocitos disponibles para la fertilización. Este procedimiento clínico es una técnica adicional al tratamiento estándar de la FIV, y debe ser preformado por personal experimentado, de acuerdo con buenas prácticas de laboratorio. 35 a 36 horas después de la inyección de gonadotropina coriónica humana, recoger los complejos de cúmulo- ovocitos recuperados en medio de manipulación independiente del dióxido de carbono.
Equilibrar los ovocitos durante 10 a 15 minutos en una incubadora independiente del dióxido de carbono a 37 grados centígrados. Exponer los ovocitos a una solución hialuronidasa alta, diluida en medio de manipulación. Después de 30 segundos, utilice una pipeta de 200 microlitrotro para eliminar mecánicamente las células cúmulos-corona.
Evaluar el número y el estado del desarrollo de los ovocitos denudados de acuerdo con la presencia o ausencia del núcleo y el primer cuerpo polar. Colocar la etapa de vesícula germinal, y la metafase I y los ovocitos de etapa metafásica II en gotas individuales de medio de cultivo independiente del dióxido de carbono, cubierto con aceite mineral. Luego, coloca los ovocitos en 37 grados Celsius, 5% dióxido de carbono y 6%oxígeno con humedad durante 3 a 4 horas.
Para preparar las placas de cultivo para el cultivo embrionario, añada el volumen adecuado de cultivo preequilibrio medio a los pozos individuales de una placa de cultivo de tamaño adecuado. Cubra las gotas con aceite mineral equilibrado, etiquete la placa con un identificador único y colóquela en un descubridor dependiente del dióxido de carbono durante al menos 20 minutos. Para preparar el plato ICSI, agregue 5 gotas de microlitro de medio de manipulación precalentó para cada ovocitos polares que muestren el cuerpo, y una gota adicional para lavar la aguja a un plato de plástico limpio.
Añadir una gota adicional de solución pvP para la inmovilización de espermatozoides antes de la inyección intracitoplasmática de espermatozoides, y superponer las gotas con aceite mineral precalentó. Asegúrese de etiquetar el plato. Luego, coloque el plato de inyección de esperma en una incubadora independiente del dióxido de carbono durante al menos 20 minutos.
Mientras la placa se está equilibrando, agregue 5 gotas de microlitro de medio de manipulación precalentó para cada ócito polar que muestre el cuerpo a un plato de cultivo de fondo de vidrio. Superpone todas las gotas con aceite mineral precalentó. Asegúrese de etiquetar el plato.
A continuación, coloque la placa en una incubadora independiente del dióxido de carbono durante al menos 20 minutos. Mientras las placas se están equilibrando, encienda la etapa calentada en el microscopio invertido y ajuste la retención estéril y la aguja de inyección de espermatozoides en los soportes de microinyección. Ponga las agujas en el foco, y seleccione el objetivo adecuado, teniendo cuidado de que el condensador esté en la posición de campo brillante.
Inserte el filtro de interferencia verde y ajuste el regulador de análisis de cristal líquido en la posición de trabajo. Ajuste el obturador a aproximadamente 50% y ajuste el polarizador circular para disminuir el ruido de fondo. Para configurar el ordenador para el examen de microscopía de luz polarizada, inicie el software de imágenes y seleccione Vídeo, Fuente de vídeo y polarAIDE en el menú Vídeo.
A continuación, cambie al vídeo en directo yendo a la página Vídeo y seleccione el icono para activar el análisis de husillo y zona. Para determinar la madurez de cada cito, transfiera todos los ovocitos a gotas individuales en el plato de fondo de vidrio preparado y coloque el plato sin tapar bajo el microscopio invertido preparado. Ponga el primer óocitos en el foco y observe la imagen de birefringencia de ovocitos detectada, ya que se procesa por ordenador y se muestra en tiempo real en la pantalla del ordenador.
Utilice las agujas de retención e inyección de esperma para girar el ovocitos de modo que el cuerpo polar esté en la posición de las 12 en punto y concéntrese en el cuerpo polar. Si la birefringencia del husillo no es claramente visible a primera vista en las proximidades de PB, toque ligeramente la zona pellucida y gire suavemente el ócito alrededor de cada eje para asegurar la alineación de la luz polarizada con las fibras del husillo de la matriz. Después de identificar todos los ovocitos positivos del husillo, transfiera los ovocitos a gotas individuales dentro del plato ICSI preparado y someta a los ovocitos a la inyección intracitoplasmática de espermatozoides de acuerdo con los protocolos estándar.
Si los ovocitos no presentan ninguna señal de husillo metafásica II detectable, coloque la placa del microscopio de luz polarizada en la incubadora independiente del dióxido de carbono durante 2 a 3 horas. Antes de volver a preformar el examen de microscopía de luz polarizada como se demostró, después de la inyección, transferir los ovocitos a las placas de cultivo de embriones preparadas para su cultivo hasta que se alcance la etapa de blastocisto. Tenga cuidado de asegurarse de que toda la micromanipulación del ovocitos humanos se lleve a cabo en un entorno de control, a 37 grados, en un pH medio de cultivo óptimo.
Las imágenes del husillo permiten la discriminación de ovocitos completamente maduros detenidos en la etapa metafásica II, de aquellos que están experimentando una importante transición maduracional. En los ovocitos retardados en el desarrollo que extruyen cuerpos polares in vitro, la ausencia de la señal de husillo metafásica II puede no reflejar necesariamente una alteración celular, pero podría indicar la progresión del ócito desde la metafase I a la etapa metafásica II. La presencia del husillo meiótico es un marcador positivo de la competencia de desarrollo de los huevos.
El aplazamiento de ICSI proporciona a los ovocitos retardados en desarrollo tiempo adicional para completar el proceso de maduración y ensamblar el husillo metafásico II antes de su inyección. Usando este enfoque, incluso los ovocitos inmaduros que se descartan rutinariamente pueden ser utilizados clínicamente, y dar lugar a embarazos exitosos.
