Este trabajo fue financiado por la Agencia de promoción de investigación austríaco (FFG; número de proyecto 850681), la iniciativa de la University of Applied Sciences superior Austria financiamiento básico (proyecto GlucoSTAR) y el centro para la innovación tecnológica en medicina (tiempo centro) recibe financiamiento básico por la provincia de alta Austria.

Según la Directiva 2010/63/EU, los experimentos con embriones aves no nacieron durante los primeros dos tercios del desarrollo embrionario no es necesario permiso de un Comité de ética.
1. almacenamiento y crianza de los huevos
<ol><li>Obtener huevos de gallina fertilizados (Tabla de materiales) de un criador local. Nota: Huevos pueden ser almacenados a 14 º C en un ambiente humidificado hasta 10 días después de la colocación antes de utilizar para los experimentos.</li>
	<li>Incubar los huevos a 38 ° C con una humedad promedio de 40-60% para 10 o 11 días en una incubadora que constantemente da vuelta los huevos.</li>
</ol>2. selección de los huevos
<ol><li>Compruebe los huevos para la fertilización después de la incubación de hasta 11 días. Utilice una luz autónoma para este paso. Sumergir el borde de la lámpara autónoma en una almohadilla de tinta y la parte puntiaguda del huevo de la vela.</li>
	<li>Para identificar la vejiga de aire, comprobar las diferencias en brillo en la parte superior del huevo. Nota: La vejiga de aire aparece como una región más transparente, redonda, mientras que la albúmina es más oscuro cuando el huevo es candled.</li>
	<li>Después de la detección de la cámara de aire, marque la ubicación Presione la lámpara ligeramente contra el huevo con la tinta previamente aplicado.</li>
	<li>Excluye huevos no fecundados en este paso, que no muestran una diferencia de brillo entre la albúmina y la vejiga de aire.</li>
</ol>3. inyección de sustancias
<ol><li>Preparar la sustancia de interés(por ejemplo, el extracto herbario o insulina) diluyendo la sustancia en la concentración de tampón de solución salina balanceada (HBSS) de Hank. Por ejemplo, 3,3 U/mL de un análogo en HBSS comercialmente disponible de la insulina.</li>
	<li>Para la aplicación del compuesto seleccionado, peck con cuidado la cáscara del huevo con un acentuado pinzas en la zona de la vejiga de aire. No forman un agujero más grande que el diámetro de la aguja de la jeringa. Inyecte la solución tampón (300 μL) que contiene la sustancia de interés en el área de grabados a través de una jeringa. Nota: Uso estériles, 1 ml jeringas, puntas de pipetas y los vasos. Use guantes y una bata de laboratorio para los experimentos.</li>
	<li>Para determinar el efecto de reducción de glucosa de la sangre de una sustancia, coloque los huevos en la incubadora para 60, 120 y 180 min, respectivamente. Para determinar niveles de glucemia basal, incluyen por lo menos 10-15 huevos de control no tratados.</li>
</ol>4. toxicidad
<ol><li>Después de la aplicación del compuesto seleccionado durante 24 h, equilibre la membrana cascarón con tampón de fosfato salino tamponado (PBS) (suficiente para cubrir la membrana de la cáscara de huevo entero) durante al menos 30 s.</li>
	<li>Retire el exceso de tampón PBS vertiendo lejos.</li>
	<li>Quitar la membrana de la cáscara de huevo cuidadosamente con una pinzas puntiagudas.</li>
	<li>Verificar los vasos sanguíneos de las lesiones y confirmar vitalidad (p. ej., movimiento) del embrión de pollo. Nota: Vea la figura 1 para la comparación de vital frente a embriones no vitales después de la aplicación de un extracto de hierbas tóxico.</li>
</ol>5. medición del valor de glucosa de sangre
<ol><li>En el momento respectivo, con cuidado retire la cáscara de huevo encima de la vejiga de aire y equilibrar la membrana cascarón con tampón PBS (suficiente para cubrir la membrana de la cáscara de huevo entero).</li>
	<li>Retire el exceso de tampón PBS vertiendo lejos.</li>
	<li>Cuidadosamente Quite la membrana cascarón con una pinzas puntiagudas.</li>
	<li>Corte y quite la membrana corioalantoideas con un micro tijera, para permitir buen acceso a vasos sanguíneos adecuados. Cortar la membrana por lo menos 2-3 cm. No corte ningún vasos grandes en la membrana para evitar la pérdida de sangre no deseados del embrión.</li>
	<li>Localizar el vaso grande que origina en el abdomen del embrión. Levantar este barco de la albúmina con una tijera de micro cerrado y coloca sobre una tira de pH de plástico. Mueva la tira de pH bajo el buque, que se celebra con la micro-tijera, y tire hacia atrás el micro tijera cuidadosamente.</li>
	<li>Quite el 1-2 mL del líquido debajo de la membrana corioalantoideas con una pipeta para evitar la dilución de la sangre en el siguiente paso. Seco del recipiente y la tira de pH con papel de filtro, antes de que el buque se corta.</li>
	<li>Cortar los vasos sanguíneos cuidadosamente con una tijera micro en un lado. No cortar completamente el recipiente. Nota: El vaso es de aproximadamente 1 mm de espesor. No corte más de la mitad de la embarcación para evitar cortar por el vaso, puede deslizarse de la tira y recolección de sangre no es posible.</li>
	<li>Recoger la sangre que se escapa en la tira de pH utilizando una pipeta. Diez microlitros de sangre se requieren para determinar los niveles de glucosa con el medidor de glucosa en sangre.</li>
</ol>6. estadística evaluación
<ol><li>Calcular el valor medio de al menos 10 huevos individuales por momento y normalizar estos valores a uno de los huevos de control (huevos tratados no o tampón).</li>
	<li>Posteriormente, determinar el porcentaje de disminución. Además, usar la insulina como control positivo. Nota: Repetir cada experimento por lo menos tres veces.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Defronzo, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Banting+Lecture.+From+the+triumvirate+to+the+ominous+octet:+a+new+paradigm+for+the+treatment+of+type+2+diabetes+mellitus.">Banting Lecture. From the triumvirate to the ominous octet: a new paradigm for the treatment of type 2 diabetes mellitus.</a> Diabetes. 58 (4), 773-795 (2009).</li><li>American_Diabetes_Association. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+and+classification+of+diabetes+mellitus.">Diagnosis and classification of diabetes mellitus.</a> Diabetes Care. 37, S81-S90 (2014).</li><li>Han Cho, N., Cavan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> IDF Diabetes Atlas. 7, (2015).</li><li>Bailey, C. 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Endocrinology. , (2016).</li><li>Lanzerstorfer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+insulin+mimetic+drugs+by+quantitative+total+internal+reflection+fluorescence+(TIRF)+microscopy.">Identification of novel insulin mimetic drugs by quantitative total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy.</a> British journal of pharmacology. 171 (23), 5237-5251 (2014).</li><li>Onur, S., St&#246;ckmann, H., Zenthoefer, M., Piker, L., D&#246;ring, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Plant+Extract+Collection+Kiel+in+Schleswig-Holstein+(PECKISH)+Is+an+Open+Access+Screening+Library.">The Plant Extract Collection Kiel in Schleswig-Holstein (PECKISH) Is an Open Access Screening Library.</a> Journal of Food Research. 2 (4), (2013).</li><li>Haselgrubler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gluc-HET,+a+complementary+chick+embryo+model+for+the+characterization+of+antidiabetic+compounds.">Gluc-HET, a complementary chick embryo model for the characterization of antidiabetic compounds.</a> PloS one. 12 (8), e0182788 (2017).</li><li>Stadlbauer, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomolecular+Characterization+of+Putative+Antidiabetic+Herbal+Extracts.">Biomolecular Characterization of Putative Antidiabetic Herbal Extracts.</a> PloS one. 11 (1), e0148109 (2016).</li><li>Greywe, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applicability+and+robustness+of+the+hen's+egg+test+for+analysis+of+micronucleus+induction+(HET-MN):+results+from+an+inter-laboratory+trial.">Applicability and robustness of the hen's egg test for analysis of micronucleus induction (HET-MN): results from an inter-laboratory trial.</a> Mutation research. 747 (1), 118-134 (2012).</li><li>Manakova, E., Hubickova, L., Kostalova, J., Zemanova, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryotoxicity+of+mirtazapine:+a+study+using+Chick+Embryotoxicity+Screening+Test.">Embryotoxicity of mirtazapine: a study using Chick Embryotoxicity Screening Test.</a> Neuro endocrinology letters. 31, 8-10 (2010).</li><li>Ribatti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+embryo+chorioallantoic+membrane+as+a+useful+tool+to+study+angiogenesis.">Chick embryo chorioallantoic membrane as a useful tool to study angiogenesis.</a> International review of cell and molecular biology. 270, 181-224 (2008).</li><li>Yoshiyama, Y., Sugiyama, T., Kanke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+diabetes+model+in+chick+embryos+treated+with+streptozotocin.">Experimental diabetes model in chick embryos treated with streptozotocin.</a> Biological &amp; pharmaceutical bulletin. 28 (10), 1986-1988 (2005).</li><li>Wolf, T., Niehaus-Rolf, C., Luepke, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+new+methodological+aspects+of+the+hen's+egg+test+for+micronucleus+induction+(HET-MN).">Some new methodological aspects of the hen's egg test for micronucleus induction (HET-MN).</a> Mutation research. 514 (1-2), 59-76 (2002).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El ensayo HET-CAM es un sistema de prueba alternativa ampliamente utilizado para los ensayos con animales en el sector12. El sistema en ovo descrito aquí representa una versión modificada del ensayo HET-CAM. Mientras que en su forma original, se realizaron experimentos de HET-CAM para estudiar las propiedades irritantes de compuestos y formulación o el análisis de la angiogénesis14,15,16, hemos adaptado el enfoque de la prueba compuestos con supuestas características insulina-mimético12. Según la Directiva 2010/63/UE, experimentos con embriones aves no nacieron durante los primeros dos tercios del desarrollo embrionario no es necesario permiso de un Comité de ética ya que estos experimentos no se consideran los experimentos con animales. Estudios recientes han demostrado la idoneidad del sistema en ovo para caracterizar la eficacia de extractos de hierbas seleccionadas, que se han identificado en una pantalla principal basado en la translocación de GLUT410, para reducir los niveles de glucemia en el ausencia de insulina12,13. Puntos críticos para un buen funcionamiento del sistema en ovo incluyen: primero, un criador confiable entrega los huevos fertilizados. El pollo marrón clásico Lohmann es una buena opción de raza. En segundo lugar, la aplicación de toxicidad pruebas para excluir los efectos tóxicos de los investigados compuesto hay que hacer. Además, la preparación de un vaso sanguíneo adecuado para recolección de sangre es importante. Es importante evitar el corte de vasos grandes en las membranas corioalantoideas sí mismo, esto puede llevar a una pérdida no preferible de la sangre. Además, antes de que el buque se corta en la tira de pH, tiene que ser le dio unas palmaditas secas con papel de filtro para evitar la dilución de la sangre recogida. Por último, un número suficiente de experimentos parece ser importante. Se recomienda utilizar al menos 10 huevos para cada punto del tiempo y una triple repetición de la experiencia respectiva.
Naturalmente, existen algunas limitaciones de este enfoque en ovo . Puesto que toma hasta 30 minutos hasta que las sustancias son absorbidas por la membrana de la cáscara de huevo y entran en contacto con las membranas corioalantoideas, no es posible cuantificar una respuesta rápida del embrión al compuesto aplicado. Además, algunos compuestos pueden ser tóxicos en la concentración aplicada, que con frecuencia resulta en lesiones de los vasos sanguíneos de las membranas corioalantoideas. Por lo tanto, pruebas de citotoxicidad basados en incubación a largo plazo de los compuestos por cerca de 24 horas parece razonable. Finalmente, se encontró que el sistema utilizado para la aplicación de los compuestos tiene un efecto significativo sobre el rendimiento de la prueba. 12 actualmente, HBSS tampón se utiliza debido a el menor efecto sobre los niveles de glucosa de la sangre del embrión.
Para futuras aplicaciones, sistemas de amortiguamiento adicional como una alternativa a HBSS pueden probarse. Además, la influencia de extractos de hierbas en parámetros adicionales de la sangre como colesterol, triglicéridos o lipoproteínas podría ser una pregunta atractiva.
Nuestro nuevo sistema en ovo es una herramienta importante y prometedor para probar sustancias con características de insulina-mimético en un organismo vivo sin la necesidad de un experimento animal. Por lo tanto, rellena el hueco entre los enfoques in vitro y in vivo . En comparación con la existente en ovo-lacto-modelo sistemas17 no hay necesidad para inducir diabetes tratamiento streptozotocin (STZ), como el uso embriones en el día 10 u 11 de la incubación. En esta etapa, no se ha iniciado la producción de insulina, pero los embriones son ya insulina sensible. Además, autorización por un Comité de ética puede ser necesario si los embriones de edad 14-17 días son usados17. Además, comparado con estrategias alternativas18, la aplicación compuesta como se describe aquí es menos dañina y laborioso, aumento de las tasas de rendimiento experimentales.
Tomados en conjunto, esta en ovo-lacto- enfoque es un sistema atractivo si es un efecto de disminución de sangre de una sustancia insulina-mimético en un organismo vivo.

Diabetes mellitus es una enfermedad metabólica caracterizada por hiperglicemia y es causada por defectos en la secreción de insulina o insulina de acción1. Noventa por ciento de los casos de diabetes son la categoría de diabetes mellitus tipo 2 (T2DM), donde individuos demuestran resistencia a la insulina y sobre todo la deficiencia de insulina2. Varios factores se saben para aumentar la incidencia global de T2DM, incluyendo cambios en el estilo de vida, especialmente las relacionadas con la sobrealimentación, el envejecimiento y la inactividad física. Cerca de 400 millones de personas tienen diabetes mellitus a nivel mundial según la Federación Internacional de Diabetes (FID). Este número se espera llegar a 600 millones en los próximos 20 años3.
Complicaciones de la diabetes causadas por la hiperglucemia y resistencia a la insulina, tales como hipertensión, dislipidemia, intolerancia a la glucosa, enfermedad coronaria y enfermedad vascular cerebral, llevan a una significativamente menor esperanza de vida y calidad4. Las personas afectadas requieren farmacoterapia reductor de la glucosa; sin embargo, el uso de medicamentos como metformina5 suele ser asociado con efectos secundarios dramáticos6,7,8. Por lo tanto, más antidiabéticos enfoques que son seguros, ampliamente disponible y barato son necesarios.
Nutracéuticos, extractos, plantas y diferentes compuestos de hierbas se han atribuido propiedades insulina-mimético característica modulando funciones celulares diferentes. Una característica importante es la estimulación de la translocación del transportador de glucosa 4 (GLUT4) a la membrana plasmática de compartimentos de almacenamiento intracelular, resultando en una mayor captación de glucosa en músculo y tejido adiposo en la ausencia de insulina, conocido como insulina-mimético propiedades9. Anteriormente, hemos implementado un enfoque basado en la microscopía de fluorescencia para cuantificar el proceso de translocación de GLUT410. Análisis de numerosos extractos de plantas de un extracto de la biblioteca11 usando este análisis resultó en la identificación de candidatos prometedores. Sin embargo, se requieren pruebas adicionales en los organismos vivos. El enfoque descrito en detalle en este documento, un modelo de embrión de polluelo modificado, ha demostrado para ser un modelo prometedor para la identificación de sustancias con propiedades insulina-mimético. Representa una herramienta atractiva, llenando el boquete amplio entre los estudios in vitro y en vivo y ofrece varias ventajas en comparación con los sistemas existentes como costos aceptables, los procedimientos de manejo sencillo y velocidades de rendimiento adecuado. Además, no se requiere autorización por un Comité de ética.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="621">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:279px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:140px;">Biochrom</td>
			<td style="width:123px;">L1825</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hank&#8217;s balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30268.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NovoRapid</td>
			<td>Novo Nordisk</td>
			<td>8-0905-82-304-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hens eggs (Lohmann classic brown chicken)</td>
			<td>Local Breeder</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Accu-check performa</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6454011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Accu-check Inform II Teststreifen</td>
			<td>Roche&#160;</td>
			<td>5942861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Incubator&#160; HEKA- Turbo 288</td>
			<td>HEKA Brutger&#228;te</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe Omnican F 1 mL</td>
			<td>Braun</td>
			<td>09161502S&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Extracts</td>
			<td>PEKISH extract library</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lamp Tempo Nr. 119</td>
			<td>ORBAN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in ovo model for testing insulin-mimetic compounds

Niveles elevados de glucemia en diabetes mellitus tipo 2 (T2DM), una enfermedad metabólica compleja y multifactorial, son causados por falta de insulina resistencia y β-celular. Diversas estrategias, incluyendo la inyección de la insulina o el uso de las drogas de insulina-sensibilización, persiguieron para tratar T2DM o al menos reducir los síntomas. Además, la aplicación de compuestos herbales ha atraído una atención creciente. Por lo tanto, es necesario encontrar sistemas de prueba eficiente para identificar y caracterizar compuestos de insulina-mimético. Aquí se desarrolló un modelo de embrión de polluelo modificada, que permite pruebas de compuestos sintéticos y extractos herbales con propiedades insulina-mimético. Usando una fluorescencia microscopía pantalla basado en primaria, que cuantifica la translocación del transportador de glucosa 4 (Glut4) a la membrana plasmática, hemos sido capaces de identificar compuestos, extractos de hierbas principalmente, que conducen a un aumento de la glucosa intracelular concentraciones en los adipocitos. Sin embargo, la eficacia de estas sustancias requiere más verificación en un organismo vivo. Por lo tanto, utilizamos un enfoque en ovo para identificar sus propiedades reductoras de glucosa de la sangre. La aprobación por un Comité de ética no es necesaria porque el uso de embriones de pollo durante los primeros dos tercios del desarrollo embrionario no se considera un experimento animal. Aquí, la aplicación de este modelo se describe en detalle.

Descripción del enfoque Gluc-HET:
Tras la incubación con las sustancias de interés, los huevos fertilizados son abiertos y preparados para recolección de sangre por eliminación de la cáscara de huevo (figura 2). Preparación incluye equilibrar y el retiro de la membrana de la cáscara de huevo para obtener acceso a las membranas corioalantoideas. Esta membrana se corta cuidadosamente para proporcionar acceso a un recipiente adecuado de sangre para recolección de sangre. Preferiblemente, el vaso grande que origina en el abdomen del embrión se coloca en una tira de pH de plástico. Para evitar la dilución de la sangre durante la colección, la nave y la tira de pH es secarlo con papel de filtro. Entonces se corta el vaso sanguíneo y se recoge la sangre que se escapa en la franja de pH para análisis mediante una pipeta.
Efectos de extractos de hierbas en los niveles de glucemia:
Con un recién creado translocación de GLUT4 cuantificación pantalla basado en primaria, que son capaces de identificar sustancias con una característica insulina-mimético10. Proyección de cientos de extractos de hierbas hidrosolubles resultó en la identificación de varios golpes. Estos extractos fueron probados en nuestro modelo en -ovo. Extractos preparados a partir de Combretum indicum (enredadera de Rangún) y un extracto no divulgada (llamado extracto 0845) fueron utilizados para estos experimentos. Hemos disuelto los extractos en tampón HBSS a 300 mg/L, una concentración que resultó para ser adecuado en anteriores estudios12,13. Sustancias se aplicaron a los embriones se incubaron durante 11 días. Como se indica en la figura 3, el extracto de la enredadera de Rangún no produjo una significativa sangre glucosa reducción en ovo. Sin embargo, la concentración de glucosa de la sangre se redujo con éxito con el extracto 0845, con una disminución menor después de 60 min, que es comparable con el efecto observado con un análogo de insulina disponible en el mercado. Se observó un efecto significativo cuando se prolongó el tiempo de incubación de los huevos.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57237/57237fig1.jpg"> Figura 1: influencia de compuestos tóxicos en la vitalidad del embrión. Huevos fueron incubados durante 11 días (A y C) o tratados con un extracto de hierbas tóxico día 10 por otro 24 h (B y D). Aplicación del extracto condujo a graves lesiones de los vasos sanguíneos de las membranas corioalantoideas (D) y el embrión (B).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57237/57237fig2.jpg"> Figura 2: Descripción del modelo en ovo . De izquierda a derecha: apertura y remoción de la cáscara del huevo (1 - 2); equilibrado y el retiro de la membrana de la cáscara de huevo con membranas corioalantoideas expusieron (3); recipiente dispuesto en una tira de pH (4); la colección de sangre y medición de la concentración de glucosa con un medidor de glucosa (5). Adaptado de Haselgruebler et al., 201712. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57237/57237fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57237/57237fig3.jpg"> Figura 3: efecto de extractos de hierbas en los niveles de glucemia en comparación con los no tratados o tratados con insulina huevos. Huevos incubados durante 11 días y fueron tratados con las sustancias indicadas (análogo de insulina disponible comercialmente: 3.3 U/mL; extractos: 300 mg/L) disuelto en tampón HBSS (volumen de 300 μL) para hasta 3 h. de sangre los niveles de glucosa se determinaron usando un medidor de glucosa en sangre. Resultados se muestran sin el efecto de la memoria intermedia. Barras de error se basan en el error estándar de la media. * P < 0.05 y *** P < 0.0001, importante disminución con respecto a los huevos tratados con HBSS del mismo tiempo de incubación. Adaptado de Haselgruebler et al., 201712. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57237/57237fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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An In Ovo Model for Testing Insulin-mimetic Compounds

En este estudio, describimos un sistema en la ovo como una herramienta prometedora para probar compuestos de insulina-mimético en un organismo vivo. Las principales ventajas incluyen velocidades de rendimiento adecuados y los costos aceptables, que permitan la identificación de sustancias fitoquímicas con propiedades insulina-mimético.

Un modelo de Ovo para probar compuestos de insulina-mimético

Elevated blood glucose levels in type 2 diabetes mellitus (T2DM), a complex and multifactorial metabolic disease, are caused by insulin resistance and ...

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An In Ovo Model for Testing Insulin-mimetic Compounds

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Video: An In Ovo Model for Testing Insulin-mimetic Compounds

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. Caged compounds are molecules made physiologically inactive by a chemical cage that can be broken by a flash of ultraviolet light. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged compounds for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons. The process of olfactory transduction (Figure 1) takes place in the cilia of olfactory sensory neurons, where odorant binding to receptors leads to the increase of cAMP that opens cyclic nucleotide-gated (CNG) channels2. Ca entry through CNG channels activates Ca-activated Cl channels. We show how to dissociate neurons from the mouse olfactory epithelium3 and how to activate CNG channels or Ca-activated Cl channels by photolysis of caged cAMP4 or caged Ca5. We use a flash lamp6,7 to apply ultraviolet flashes to the ciliary region to uncage cAMP or Ca while patch-clamp recordings are taken to measure the current in the whole-cell voltage-clamp configuration8-11.

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged cAMP or caged Ca for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons.

Flash fotólisis de compuestos enjaulados en los cilios de las neuronas sensoriales olfativas

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Investigación

Neurociencias

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain dopaminergic neurons is implicated in Parkinson's disease, Schizophrenia, depression, and dementia1-5. Thus, studying the regulation of midbrain dopaminergic neuron differentiation could not only provide important insight into mechanisms regulating midbrain development and neural progenitor fate specification, but also help develop new therapeutic strategies for treating a variety of human neurological disorders.
Dopaminergic neurons differentiate from neural progenitors lining the ventricular zone of embryonic ventral midbrain. The development of neural progenitors is controlled by gene expression programs6,7. Here we report techniques utilizing electroporation to express genes specifically in the midbrain of Hamburger Hamilton (HH) stage 11 (thirteen somites, 42 hours) chick embryos8,9. The external development of chick embryos allows for convenient experimental manipulations at specific embryonic stages, with the effects determined at later developmental time points10-13. Chick embryonic neural tubes earlier than HH stage 13 (nineteen somites, 48 hours) consist of multipotent neural progenitors that are capable of differentiating into distinct cell types of the nervous system. The pCAG vector, which contains both a CMV promoter and a chick &beta;-actin enhancer, allows for robust expression of Flag or other epitope-tagged constructs in embryonic chick neural tubes14. In this report, we emphasize special measures to achieve regionally restricted gene expression in embryonic midbrain dopaminergic neuron progenitors, including how to inject DNA constructs specifically into the embryonic midbrain region and how to pinpoint electroporation with small custom-made electrodes. Analyzing chick midbrain at later stages provides an excellent in vivo system for plasmid vector-mediated gain-of-function and loss-of-function studies of midbrain development. Modification of the experimental system may extend the assay to other parts of the nervous system for performing fate mapping analysis and for investigating the regulation of gene expression.

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

To assess the function and the regulation of genes during the development of midbrain dopaminergic neurons, we describe a method that involves in ovo electroporation of plasmid DNA constructs into embryonic chick ventral midbrain dopaminergic neuron progenitors. This technique can be used to achieve efficient expression of genes of interest to study different aspects of midbrain development and dopaminergic neuron differentiation.

En electroporación in ovo en el mesencéfalo polluelo para estudiar la función génica en el desarrollo neuronal dopaminérgica

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain ...

Design and Assembly of an Ultra-light Motorized Microdrive for Chronic Neural Recordings in Small Animals

The ability to chronically record from populations of neurons in freely behaving animals has proven an invaluable tool for dissecting the function of neural circuits underlying a variety of natural behaviors, including navigation1 , decision making 2,3, and the generation of complex motor sequences4,5,6. Advances in precision machining has allowed for the fabrication of light-weight devices suitable for chronic recordings in small animals, such as mice and songbirds. The ability to adjust the electrode position with small remotely controlled motors has further increased the recording yield in various behavioral contexts by reducing animal handling.6,7
 Here we describe a protocol to build an ultra-light motorized microdrive for long-term chronic recordings in small animals. Our design evolved from an earlier published version7, and has been adapted for ease-of use and cost-effectiveness to be more practical and accessible to a wide array of researchers. This proven design 8,9,10,11 allows for fine, remote positioning of electrodes over a range of ~ 5 mm and weighs less than 750 mg when fully assembled. We present the complete protocol for how to build and assemble these drives, including 3D CAD drawings for all custom microdrive components.

The design, fabrication and assembly of an ultra-light motorized microdrive is described. The device provides a cost-effective and easy-to-use solution for chronic recordings of single units in small behaving animals.

Diseño y montaje de un Microdrive ultraligero motorizado para crónicos Grabaciones neuronales en Pequeños Animales

The ability to chronically record from populations of neurons in freely behaving animals has proven an invaluable tool for dissecting the function of ...

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial and temporal control of ectopic microRNA expression. However, ventral brain structures like ventral midbrain are rather difficult to reach for any manipulations. Here, we demonstrate an efficient way to electroporate miRNA into ventral midbrain using thin platinum electrodes. This method offers a reliable way to transfect specific areas of the midbrain and a useful tool for in vivo studies.

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

Ectopic expression is one technique to elucidate the microRNAs role in brain development. However, targeting specific areas using in ovo electroporation is challenging. Here, we show an efficient way to selectively electroporate ventral and dorsal midbrain regions.

En Expression in ovo de microARN en ventral del polluelo Midbrain

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial ...

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

Measurement of the visual function in the tadpoles of the frog, Xenopus laevis, allows screening for blindness in live animals. The optokinetic response is a vision-based, reflexive behavior that has been observed in all vertebrates tested. Tadpole eyes are small so the tail flip response was used as alternative measure, which requires a trained technician to record the subtle response. We developed an alternative behavior assay based on the fact that tadpoles prefer to swim on the white side of a tank when placed in a tank with both black and white sides. The assay presented here is an inexpensive, simple alternative that creates a response that is easily measured. The setup consists of a tripod, webcam and nested testing tanks, readily available in most Xenopus laboratories. This article includes a movie showing the behavior of tadpoles, before and after severing the optic nerve. In order to test the function of one eye, we also include representative results of a tadpole in which each eye underwent retinal axotomy on consecutive days. Future studies could develop an automated version of this assay for testing the vision of many tadpoles at once.

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

Xenopus laevis tadpoles prefer swimming on the white side of a black/white tank. This behavior is guided by their vision. Based on this behavior, we present a simple assay to test the visual function of tadpoles.

Un ensayo de comportamiento simple para Pruebas de función visual en<em&gt; Xenopus laevis</em

Measurement of the visual function in the tadpoles of the frog, Xenopus laevis, allows screening for blindness in live animals. The optokinetic response ...

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell leukodystrophy (GLD) is unclear. This gap in knowledge has been hindered by the lack of an appropriate in vitro model for study. Herein, we describe a primary murine glial culture system in which treatment with psychosine results in multinucleation of microglia resembling the characteristic globoid cells found in GLD. Using this novel system, we defined the conditions and modes of analysis for study of globoid cells. The potential use of this model system was validated in our previous study, which identified a potential role for matrix metalloproteinase (MMP)-3 in GLD. This novel in vitro system may be a useful model in which to study the formation and function, but also the potential therapeutic manipulation, of these unique cells.

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

Globoid cells are a defining pathological feature of Krabbe disease, a leukodystrophy currently lacking an effective long-term therapy. We have developed a cell culture model to study the innate biology and pathogenic potential of activated microglia and their transformation into globoid cells.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo para el Estudio del Celular Fisiopatología en globoides Leucodistrofia Celular

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

Simultáneo<em&gt; Ex vivo</em&gt; Pruebas funcionales de dos retinas por<em&gt; In vivo</em&gt; Sistema Electrorretinograma

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

Método electrofisiológico para registrar las respuestas de voltaje intracelular<em&gt; Drosophila</em&gt; Los fotorreceptores y interneuronas a la luz Estímulos<em&gt; En Vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier (BBB). Rats with induced ischemic stroke were established and used as in vivo models to investigate the functional integrity of the BBB. Spectrophotometric detection of Evans blue (EB) in the brain samples with ischemic injury could provide reliable justification for the research and development of novel therapeutic modalities. This method generates reproducible results, and is applicable in any laboratory without a need for special equipment. Here, we present a visualized and technical guideline on the detection of the extravasation of EB following induction of ischemic stroke in rats.

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

The overall goal of this procedure is to provide a highly reproducible technique for in vivo assessment of the blood-brain barrier disruption in rat models of ischemic stroke.

Una evaluación In Vivo de la interrupción de la Barrera Blood - Brain en un modelo de rata de ictus isquémico

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier ...

A Preclinical Model to Assess Brain Recovery After Acute Stroke in Rats

The purpose of this study was to establish and validate an animal brain ischemia model in the recovery and sequela stages. A middle cerebral artery occlusion/reperfusion (MCAO/R) model in male Sprague-Dawley rats was chosen. By changing the rat&#39;s weight (260&#8722;330 g), the thread bolt type (2636/2838/3040/3043) and the brain infarct time (2-3 h), a higher Longa&#39;s score, a larger infarct volume and a greater model success ratio were screened using the Longa&#39;s score and TTC staining. The optimum model condition (300 g, 3040 thread bolt, 3 h brain infarct time) was acquired and used in a 1-90 day observation period after reperfusion via assessment of sensorimotor functions and infarct volume. At these conditions, the bilateral asymmetry test had a significant difference from 1 to 90 days, and the grid-walking test had a significant difference from 1 to 60 days; both differences could be a suitable sensorimotor functional test. Thus, the most appropriate condition of a novel rat model in the recovery and sequela stages of brain ischemia was found: 300 g rats that underwent MCAO with a 3040 thread bolt for a 3 h brain infarct and then reperfused. The appropriate sensorimotor functional tests were a bilateral asymmetry test and a grid-walking test.

The&#160;purpose of this study is to establish and validate an animal model for research in the recovery and sequela stages of brain ischemia by testing brain infarction and sensorimotor function after middle cerebral artery occlusion/reperfusion (MCAO/R) after 1-90 days in rats.

Un modelo preclínico para evaluar la recuperación cerebral después de un accidente cerebrovascular agudo en ratas

The purpose of this study was to establish and validate an animal brain ischemia model in the recovery and sequela stages. A middle cerebral artery ...