Este ensayo permite al estudiante buscar moléculas específicas en muchos procesos de desarrollo, como la diferenciación celular y la morfogénesis mediante la implantación de las perlas en distintas regiones embrionarias. Este protocolo se puede aplicar a cualquier modelo animal experimental, cultivo celular, modelo organotípico, incluidos los organoides. Además, es una herramienta educativa útil para enseñar biología básica del desarrollo a los estudiantes.
Demostrando el procedimiento estará Alexandra Gonzales-Gonzales, una estudiante de pregrado del laboratorio. Para comenzar, incuba los huevos de gallina Leghorn blancos fertilizados verticalmente con el lado puntiagudo hacia abajo en una incubadora humidificada a 38 grados centígrados y 70% de humedad relativa. Una vez que lleguen a la etapa 28, según Hamburger y Hamilton, retire los huevos de la incubadora, cámbielos con etanol al 70% y déjelos secar al aire.
Luego desinfecte el área de trabajo, microscopios e instrumentos con etanol al 70%. A continuación, incline los huevos para identificar los vasos sanguíneos y localizar el embrión. Deseche los óvulos que no tengan un embrión.
Usando el extremo de pinzas no dentadas, abra una ventana tocando el extremo romo de un huevo y retire una sección de cáscara de un centímetro cuadrado. Luego, transfiera el huevo a un cartón o soporte de plástico y colóquelo debajo del microscopio estereoscópico. Usando fórceps quirúrgicos finos, retire cualquier pequeño trozo de cáscara de huevo que pueda entrar en contacto con el embrión y elimine la membrana de aire perforándola y sacándola.
A continuación, utilizando pinzas quirúrgicas finas, rasgue ligeramente el saco amniótico, teniendo cuidado de no dañar la vasculatura de la membrana corioalantoica. Estadificar los embriones in-ovo para determinar si están en la etapa deseada. Para la preparación de cuentas de heparina Affi-gel, corte una sección de parafilm de forma cuadrada para que quepa en una placa de Petri de 45 milímetros.
Después de colocar la parapelícula en la parte inferior de la placa de Petri, usando el extremo de las pinzas no dentadas, empuje cada vértice y fíjelo al fondo de la placa. A continuación, con una pipeta o espátula, transfiera las perlas a un tubo de micro centrífuga y lávelas dos veces con PBS permitiéndoles asentarse y pipetear el sobrenadante. Luego, usando una micro pipeta, transfiera de 40 a 50 cuentas al centro de la placa de Petri cubierta de parafilm.
Bajo un microscopio, seleccione 30 perlas de Affi-gel o heparina que tengan un diámetro de 100 micrómetros. Dimensiona las cuentas usando un tercer interdigit de un embrión de 28 etapas como referencia. La cuenta debe ser más pequeña que el interdigit.
Después de eliminar cuidadosamente el exceso de PBS que rodea las perlas seleccionadas, sumérjalas en dos a cinco microlitros de la solución de tratamiento. Incubar las perlas en la solución durante 30 minutos a temperatura ambiente. Durante la incubación, para evitar que las perlas se sequen, pipetee unas gotas de PBS o agua alrededor de las perlas para humidificar la atmósfera local y cubra el plato con parafilm para retardar la evaporación.
Vierta la preparación de cuentas AG1X2. Use la espátula para transferir las perlas a un tubo de micro centrífuga y agregue 50 microlitros de la solución de tratamiento a la concentración final deseada. Después de envolver los tubos con papel de aluminio para protegerlos de la luz, incube las cuentas durante 20 minutos con agitación lenta.
Después de la incubación, usando una pipeta, retire la mayor cantidad posible de la solución de tratamiento en la mancha con rojo fenol al 0,2% disuelto en agua durante dos minutos con agitación leve en un vórtice. Después de manchar, retire el tinte, luego lave las cuentas dos veces en PBS para eliminar cualquier tinte residual. A continuación, utilizando una punta de micro pipeta, transfiera de 40 a 50 cuentas AG1X2 al centro de la placa de Petri cubierta de paraforma y remoje las cuentas en cinco microlitros de PBS.
Luego, bajo un microscopio, seleccione alrededor de 30 cuentas de 100 micrómetros de diámetro de tamaño. Sumerja las perlas seleccionadas en la solución experimental con unas gotas de PBS o agua alrededor de las perlas para humidificar la atmósfera local. Cubra el plato con parafilm para retardar la evaporación.
Antes de manipular los embriones, coloque dos microscopios estereoscópicos uno al lado del otro en una mesa de trabajo. Luego, usando fórceps no dentados, cree una ventana en los huevos restantes. A continuación, bajo el microscopio, desgarre la membrana amniótica cerca de la extremidad posterior derecha con fórceps quirúrgicos finos.
Usando fórceps finos, sostenga el embrión por la membrana amniótica para exponer la extremidad posterior derecha. Luego, usando una aguja fina de tungsteno, haga un agujero centrado en el distal más alejado del tercer interdigit de la extremidad posterior. Sin liberar el embrión y la extremidad posterior expuesta, tome una cuenta tratada del otro microscopio usando una de las puntas de los fórceps.
Las pinzas deben estar abiertas para que una cuenta se adhiera a su punta. Transfiera la cuenta al embrión de pollito cerca de la extremidad posterior, colocándola en la parte superior del orificio intermedio. aplicar presión sobre la cuenta cerrando las pinzas hasta que entre en el orificio.
Luego suelte el embrión, selle la ventana de la cáscara del huevo con cinta adhesiva y devuelva los huevos a la incubadora hasta que hayan alcanzado la etapa requerida. Para garantizar la eficacia del ensayo, la cuenta debe colocarse de manera consistente y precisa en la ubicación correcta. En este estudio, la cuenta empapada se colocó en el distal más alejado del tercer interdigit debajo de la cresta ectodérmica apical.
Los embriones se pueden teñir con azul océano y rojo alizarina para evidenciar la formación de elementos esqueléticos y evaluar los efectos sobre la diferenciación celular. Este ensayo también es adecuado para evaluar la muerte celular con rojo neutro y la regulación génica, comprando hibridación C2. La principal ventaja de esta herramienta experimental es controlar el tiempo y la ubicación de las cuentas empapadas.
La combinación del posicionamiento central con el tiempo preciso del desarrollo proporciona enormes posibilidades para estudiar los procesos de diferenciación celular.
