Las entidades de unión a SUMO permiten aislar proteínas SUMOiladas endógenas in vivo. Esto es bastante difícil debido a la presencia de proteasa activa específica de SUMO y las bajas fracciones de proteínas SUMOylated in vivo. El aislamiento del proteome SUMOylated mediante el uso de entidades de unión SUMO es ventajoso, ya que aplaza un aumento en la afinidad general por sustratos SUMO.
Esto se debe al hecho de que los SUBEs son comunes en proteínas que comprenden repeticiones en tándem de SIM, reconociendo así específicamente moléculas SUMO en proteínas modificadas. El uso de entidades de unión SUMO para el aislamiento y caracterización del proteomo SUMOylated en el cáncer de hígado es un método rápido y sensible. Proporciona información pasada sobre el papel bastante desconocido de la vía de suma en el cáncer de hígado en un enfoque terapéutico potencial.
Las entidades de unión SUMO se pueden utilizar para aislar y caracterizar el proteomo SUMOylated en otros tejidos además del hígado, tanto de muestras humanas como de modelos animales, así como en varios modelos celulares. Aunque esta técnica es fácil de realizar, se debe tener cuidado al analizar varias muestras en el mismo tipo. más frío a los varios pasos involucrados.
Por lo tanto, recomendamos una nivelación cuidadosa de los tubos antes de iniciar este experimento. La demostración visual del uso de entidades vinculantes SUMO facilita la revolución de este protocolo especialmente debido a las dificultades de manejo de los bits y la pérdida de material durante el protocolo. Las células de hepatoma humanas se han preparado previamente mediante el recubrimiento de células en placas P100 a una densidad de 1,2 a 1,5 millones de células por plato y las mantienen en medios de crecimiento estándar a 37 grados centígrados.
Cuando esté listo para usar las células, aspire el medio de las placas y lávelos con cinco milímetros de PBS estéril. Coloque la placa sobre hielo y agregue 500 microlitros de tampón de lelisis complementados de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Luego usa un rascador de células para raspar suavemente las células de la parte inferior de la placa en el medio de la lysis.
Alternativamente, cosecha las células por tripsinización y agrega un mililitro de trippsina-EDTA a la placa asegurándote de que las células estén cubiertas. Coloque la placa en una incubadora de 37 grados Celsius durante cinco minutos para permitir que se desprendan de la placa, luego agregue dos mililitros de medio de crecimiento precalentó para detener la trippsinación. Centrifugar las células a 150 veces G durante 10 minutos y aspirar el sobrenadante.
Luego lave las células con PBS y centrifugar durante otros 10 minutos. Aspirar el sobrenadante y añadir 500 microlitros de tampón de lelisis. Centrifugar las células de la lese a 15000 veces G y cuatro grados Celsius durante 10 minutos, luego transfiera los sobrenadantes a un tubo fresco y deseche el pellet.
Cuando esté listo para usar los hígados de ratón cosechados, homogeneice 75 miligramos de fragmentos congelados frescos o es ajustados en un mililitro de tampón de lysis helada. Ejecute el homogeneizador de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Después de la homogeneización del tejido, centrifugar las muestras a 15000 veces G y cuatro grados Celsius durante 10 minutos.
Transfiera el sobrenadante a un tubo fresco y deseche el pellet. Preparar cuentas de glutatión añadiendo un mililitro de agua desimaso a 70 miligramos de cuentas y reconstituyéndolas durante la noche en cuatro grados Celsius. Después de la hinchazón, lave las cuentas tres veces con 10 mililitros de agua desimasoonizada o PBS, centrifugando a 300 veces G durante cinco minutos después de cada lavado.
Después de los lavados, resuspender las perlas en un mililitro de PBS para obtener una suspensión del 50% para cada muestra a 100 microgramos de GST-SUBEs o control GST a 100 microlitros de la lodo de perlas de glutatión y 500 microlitros de PBS. Incubar la mezcla a cuatro grados centígrados durante al menos dos horas mientras gira, luego recuperar las perlas por centrifugación a 300 veces G durante cinco minutos y resuspend las resuspender en PBS. Tome el 10% del lisato celular previamente preparado y diluya en un volumen igual de tampón de ebullición 3X.
Añadir 450 microlitros del licato clarificado a 100 microlitros de la suspensión de perlas de glutatión. Incubar el izado con las perlas a cuatro grados centígrados durante al menos dos horas mientras gira lentamente. Después de la incubación, gire hacia abajo las cuentas a 300 veces G durante cinco minutos y recoja el sobrenadante para su análisis.
Transfiera el 10% del volumen total a un tubo separado y añada un volumen igual de tampón de ebullición 3X. Lave la muestra restante tres veces añadiendo un mililitro de PBS helado con 05%Tween 20 y girando hacia abajo a 300 veces G y cuatro grados centígrados durante un minuto. Aspirar cuidadosamente el sobrenadante asegurándose de que no quede líquido.
A continuación, eluda la muestra con 15 microlitros de tampón de ebullición 3X y 15 microlitros de tampón de lisis. Ejecute un análisis de manchas occidentales de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Si realiza la espectrometría de masas, desalte los péptidos utilizando microcolumnas C18 de punta de etapa y resusppend en ácido fórmico del 0,1% antes del análisis.
Cargue las muestras en un sistema LC-MS y analícelas por triplicado. Continúe con la identificación de proteínas y el cálculo de la abundancia utilizando el software asociado. Realice análisis estadísticos de acuerdo con las instrucciones del manuscrito.
Este protocolo se ha utilizado para aislar las proteínas SUMOylated en ratones con deficiencia de glicina N-metiltransferasa que causa el desarrollo espontáneo del cáncer de hígado y sus littermatos de tipo salvaje. La tinción de Ponceau S se realizó en las fracciones de entrada, flujo y BOUND del ensayo desplegable SUBEs. El análisis de LKB1 de LKB1 capturado con SUBEs muestra que los niveles de SUMA DE LKB1 se incrementan en tumores hepáticos.
Las células hepatoma humanas y las células epiteliales hepáticas no transformadas se utilizaron para investigar la capacidad de la trampa SUMO para interactuar con proteínas SUMOylated naturalmente. En primer lugar, se utilizó la tinción de proteínas convencional para visualizar el material total capturado con LOS SUBEs. Entonces la espectrometría de masas mostró que 742 proteínas se enriquecieron en la muestra de SUBEs de células de hepatoma y 577 se enriquecieron en la muestra de SUBEs de células epiteliales no transformadas del hígado.
Al realizar experimentos con SUBEs, es importante mantener las células y tejidos en el hielo y añadir mililitros específicos al tampón de la leliación para mantener la pureza de SUMOylated. Después de la visualización del proteome SUMOylated con SUBEs, podemos encontrar la caracterización utilizando el análisis de manchas occidentales o la espectrometría de masas. La aplicación de los SUBEs para aislar y caracterizar el proteoma SUMOylated en los tejidos del cáncer hepático y las células del hepatoma está allanando el camino para explorar el papel de las modificaciones post-traduccionales del SUMO en el cáncer de hígado que pueden proporcionar un mecanismo terapéutico potencial.
