La importancia de este protocolo es el uso de una nueva proteína UTAG fluorescente que atrapa SUMO para la detección del modificador de proteína SUMO en varias células eucariotas. La principal ventaja de esta técnica es un protocolo sencillo para la detección libre de anticuerpos de SUMO en una variedad de células, incluyendo el cultivo de tejidos de mamíferos y gónadas de nematodos. SUMO desempeña un papel importante en el cáncer y los trastornos neurodegenerativos, y esto subraya la necesidad de herramientas robustas y confiables para la detección y el análisis funcional de proteínas modificadas por SUMO.
Debido a que SUMO está altamente conservado, la proteína UTAG de captura suMO fluorescente se puede utilizar para etiquetar SUMO conjugado en muchos organismos diferentes. Este video demuestra su uso en células de mamíferos. Además, el texto completo describe su uso en ovocitos de nematodos.
La demostración visual de esta técnica proporciona pistas críticas para el tratamiento de las células antes de la tinción y la detección de SUMO. Para empezar, el cultivo de células de cultivo de tejido de elección en la cubierta redonda de 22 milímetros se desliza en placas TC de seis pozos hasta 70 a 80% confluentes. Lave brevemente las células con un mililitro de DPBS.
Para fijar las celdas, agregue dos mililitros de 4%PFA y DPBS frescos a cada pozo. Incubar las células durante 20 minutos a temperatura ambiente. Lave las células fijas tres veces durante cinco minutos en un mililitro de DPBS mientras se nutra la placa.
Para permeabilizar las células, incubar durante 15 minutos con 1%Tritón X-100 en DPBS. Lave las células de nuevo, como antes. Incubar las células con 500 microlitros de 1 pH HCL de glicina molar 2 durante 10 segundos.
A continuación, neutralice el pH inmediatamente con 500 microlitros de 10X SUMO Proteasa buffer, o SPB. Después de lavar las células como antes, retire los resbalones de la cubierta del pozo y colóquelos en una cámara de humedad. Para la tinción UTAG-FL solamente, mezcle un microgramo de UTAG-FL con 100 microlitros de 1X SPB que contengan cinco TCEP mililolares en un tubo.
A continuación, pipetear la mezcla en las celdas de la cubierta y la incubar a temperatura ambiente durante una hora en la cámara de humedad. Para lavar los resbalones de la cubierta, pipetee 200 microlitros de DPBS en cada resbalón de cubierta y déjelo en su lugar durante 10 minutos. Repita el lavado dos veces más.
Retire los resbalones de la cubierta del último lavado e invierta en un portaobjetos pre-limpiado con una gota de medio de montaje. Guarde las muestras durante la noche en un congelador celsius de 20 grados antes de verlos bajo el microscopio. Visualice las celdas utilizando los conjuntos de filtros adecuados para DAPI y Texas Red.
Consulte el texto completo de un protocolo sobre cómo etiquetar las gónadas SUMO y nematodos fijos. Si bien el etiquetado de las células de los mamíferos es bastante sencillo, etiquetar los ovocitos nematodos requiere un entrenamiento previo en las disecciones gónadas. KmUTAG-FL incubado con células PMT2 fijas mostró una tinción nuclear distinta.
Tanto la tinción nuclear difusa como los distintos focos nucleares eran visibles. La localización nuclear se confirmó utilizando la co-tinción con DAPI. De acuerdo con la actividad de captura SUMO de KmUTAG-FL, el patrón de localización nuclear recordaba a la tinción SUMO23.
La comanteta con anticuerpo anti-SUMO23 8A2 confirmó la co-localización de KmUTAG-FL con la señal SUMO23. Esto valida la eficacia de KmUTAG-FL para detectar SUMO23 en células de mamíferos. Gónadas aisladas de hermafrodita adulta productora de ovocitos c.
los nematodos de elegans fueron etiquetados con anticuerpos anti-SUMO. De acuerdo con informes anteriores, anticuerpos anti-SUMO inicialmente localizados en el plasmo nuclear de los oocitos de profosa miótica tardía. Luego se redistribuyó al complejo de anillos centrales de los homólogos emparejados a medida que la envolvente nuclear se rompía y los cromosomas se congresoban hacia la placa metafásica.
En preparaciones paralelas, las gónadas etiquetadas con KmUTAG-FL revelaron patrones similares. KmUTAG-FL cambió de etiquetar el nucleoplasmo a concentrarse en el complejo de anillos a medida que los ovocitos comenzaron y completaron el proceso de descomposición de la envolvente nuclear. Estos resultados validan KmUTAG-FL como una herramienta útil para el análisis de la miosis y los procesos relacionados con SUMO en c.
elegans y posiblemente otros nematodos. Al realizar la fijación, es fundamental utilizar paraformaldehído fresco y un corto tiempo de fijación para mantener suMO plegado de forma nativa para que pueda ser reconocido por el KmUTAG. Dado que la estructura terciaria de SUMO está altamente conservada, es muy probable que las variantes SUMO de sistemas adicionales de modelos y no modelos puedan ser analizadas con el reactivo KmUTAG-FL.
Actualmente, estamos utilizando esta nueva proteína UTAG fluorescente que atrapa SUMO para estudiar la función de SUMO durante el estrés celular. Por último, tenga en cuenta que todos los pasos que utilizan el paraformaldehído fijado deben realizarse en una campana de seguridad de laboratorio y este reactivo debe eliminarse correctamente.
