Por lo tanto, los cultivos de mamosfera proporcionan un sistema motor de fácil acceso para estudiar y diseccionar aspectos importantes de lo normal en los comportamientos de células madre mamarias con cáncer, incluida su capacidad de autore renovarse y diferenciarse. Nuestro enfoque cuantitativo tiene como objetivo la evaluación de la tasa de crecimiento de los cultivos de mamosfera de una manera objetiva, permitiendo una comparación directa de diferentes tipos y condiciones celulares. Para el primer ensayo, aconsejo mantener un control estricto sobre los tiempos de incubación para evitar la sobre digestión y para asegurar un recuento celular preciso antes de cada chapado.
Demostrando el procedimiento con Charolaise Bull estará Errico D'Elia, un técnico de mi laboratorio. Después de cosechar las cuatro glándulas de mamíferos torácicos abdominales e inferiores de 5 a 30, 8 a 10 ratones hembra de edad, coloque hasta 20 glándulas por plato de petri de 100 milímetros en un volumen mínimo de DPBS. Picar los tejidos en trozos más pequeños y añadir 10 mililitros de medio digestivo a los fragmentos.
Utilice una pipeta serológica de 25 mililitros para transferir las piezas de tejido a un tubo cónico de 50 mililitros y sellar el tubo con película de parafina. A continuación, incubar los fragmentos en un rotador a 0,03 X G durante 2 horas y media a 37 grados y 5% de dióxido de carbono con humedad. Al final de la incubación, si todos los fragmentos se pueden pasar a través de la punta de la pipeta P1000, sedimentar la suspensión del tejido por centrifugación y decantar cuidadosamente el sobrenadante.
Vuelva a suspender el pellet en 3 mililitros de PBS y filtre el contenido del tubo secuencialmente a través de un colador celular de 100, 170, 140 micrómetros en un nuevo tubo cónico, lavando cada colador con 2 mililitros de DPBS fresco después de cada filtro. Pele el Dóserculo de las células por centrifugación y decantar el sobrenadante suspendiendo las células en el DPBS restante. Mezclar las células con un volumen igual de tampón de lysis de potasio de cloruro de amonio ylyse los glóbulos rojos en hielo durante un máximo de 5 minutos.
Al final de la incubación, detener la lelisis con 10 mililitros de DPBS y recoger las células por centrifugación. Confirmar la presencia de un pellet blanco y volver a suspender el pellet en 1 a 5 mililitros de media de mamosfera para el recuento. Luego platina las células sobre la adhesión ultra baja tratada por cultivo de tejido seis placas de pozo a una 2 x 10 a las quintas células viables por mililitro de concentración media de mamosfera para una incubación de 7 a 10 días a 37 grados Celsius y 5% dióxido de carbono.
Al final del cultivo de 7 a 10 días, recoger las mamíferos primarias de cada pozo de la placa de cultivo celular y sedimentar las mamíferos por cetrifugación. Después de decantar el sobrenadante, utilice una pipeta P200 con una punta filtrada para pipetear las masferas aproximadamente 100 veces. La generación de pacientes con células individuales es fundamental para la cuantificación precisa de la célula de la mamosfera para la nueva labilidad.
Inspeccione visualmente la extensión de la segregación y utilice el colador celular si es necesario. Re suspenda las mafiosas desasociadas con 1 a 5 mililitros de medio de mamosfera fresca para el recuento y placa 2 X 10 a las cuartas células viables por mililitro en polihema recubierto de adhesión ultra baja seis placas de pozo para un cultivo de 5 a 7 días. Luego, después de 5 a 7 días, cuenta el número de esferas por pozo.
Al final de cada pasaje, utilice una cámara digital montada en un estereoscopio para escanear toda la superficie de todos los pozos para imaginar las esferas. Después de guardar las imágenes, como archivos tif, importe las imágenes del estereoscopio como una secuencia de imágenes en ImageJ y establezca la escala y el tipo de imagen en 8 bits. Duplica la pila de imágenes y selecciona Restar fondo en la pestaña Proceso.
Compruebe las opciones Fondo claro y Paraboloides deslizantes y haga clic en Aceptar para procesar todas las imágenes de la pila. Seleccione Ajustar y umbral en la pestaña Imagen y haga clic en Aplicar. Aparecerá una ventana emergente.
Seleccione Predeterminado como Método y Luz como fondo. Marque el cuadro Calcular umbral para cada imagen y haga clic en Aceptar. Para procesar todas las imágenes de la pila, seleccione Cuenca hidrográfica y haga clic en Sí. Seleccione Abrir y haga clic en Sí y seleccione E erosionar y haga clic en Sí.
A continuación, seleccione Analizar partículas en el menú Analizar y establezca el umbral de tamaño mínimo en 10.000 micrómetros al cuadrado y la Circularidad entre 0,50 y 1,00. Seleccione la opción Elipses en el menú desplegable Mostrar y active Resumir, Excluir en los bordes y Mostrar in situ. A continuación, haga clic en Aceptar para procesar todas las imágenes de la pila.
Para calcular la curva de crecimiento acumulativo para cada pasaje, registre el número de celdas chapadas y el número de celdas en esferas contadas por pozo y calcule el tamaño de la esfera al final de cada pasaje. Deduzca el número de esferas chapadas, dividiendo el número de celdas chapadas para cada paso por el tamaño de la esfera calculado al final del pasaje anterior. Calcule el número de celda acumulativa para cada pozo por paso y el número de esfera acumulativa para cada pozo por pasaje y trace los puntos de datos en una escala semi-logarítmica.
A continuación, una línea de tendencia exponencial a los puntos de datos y calcular el coeficiente de determinación para medir la bondad del ajuste. A continuación, represente la ecuación de la línea de tendencia como una función exponencial natural para inferir la tasa de crecimiento de la cultura. En este experimento, se determinaron la esfera y los números de celda de cinco pasajes consecutivos, para tres experimentos independientes.
Aquí en los números de celda y esfera acumulativas por paso se muestran. Como se observó la activación de Myc, conduce a un aumento de las tasas de crecimiento de la esfera y la célula. Los puntos de tiempo biológicos y relevantes se pueden seleccionar para la recolección celular o para realizar análisis de expresión génica u otros activos funcionales para evaluar la diferenciación celular, la migración y la invasión.
Este es un enfoque simple y rentable con múltiples aplicaciones. Por ejemplo, se puede utilizar en el descubrimiento directo para medir los efectos sobre la proliferación de células madre de cáncer y la auto-renovación.
