Ainsi, les cultures de mammosphère fournissent un système moteur facilement accessible pour étudier et disséquer des aspects importants de la normale dans les comportements des cellules souches du sein cancéreuses, y compris leur capacité à se renouveler et à se différencier. Notre approche quantitative vise à évaluer le taux de croissance des cultures de mammosphère d’une manière objective, permettant une comparaison directe des différents types et conditions cellulaires. Pour le premier essai, je conseillerais de garder un contrôle serré sur les temps d’incubation pour éviter une digestion plus et d’assurer un nombre précis de cellules avant chaque placage.
Errico D’Elia, technicien de mon laboratoire, fera la démonstration de l’intervention avec Charolaise Bull. Après avoir récolté les quatre glandes mammaires abdominales et thoraciques inférieures de 5 à 30, souris femelles âgées de 8 à 10 semaines, placez jusqu’à 20 glandes par boîte de Pétri de 100 millimètres dans un volume minimal de DPBS. Hacher les tissus en petits morceaux et ajouter 10 millilitres de milieu digestif aux fragments.
Utilisez une pipette sérologique de 25 millilitres pour transférer les morceaux de tissu dans un tube conique de 50 millilitres et sceller le tube avec du film de paraffine. Puis incuber les fragments sur un rotateur à 0,03 X G pendant 2 1/2 heures à 37 degrés et 5% de dioxyde de carbone avec l’humidité. À la fin de l’incubation, si tous les fragments peuvent être passés à travers la pointe de pipette P1000, sédimenter la boue tissulaire par centrifugation et décanter soigneusement le surnatant.
Suspendez la pastille en 3 millilitres de PBS et filtrez le contenu du tube séquentiellement à travers une passoire cellulaire de 100, 170, 140 micromètres dans un nouveau tube conique, lavant chaque passoire avec 2 millilitres de DPBS frais après chaque filtre. Pelleter les cellules par centrifugation et décanter le supernatant de suspendre les cellules dans le DPBS restant. Mélanger les cellules avec un volume égal de tampon de lyse de potassium chlorure d’ammonium et lyser les globules rouges sur la glace jusqu’à 5 minutes.
À la fin de l’incubation, arrêter la lyse avec 10 millilitres de DPBS et recueillir les cellules par centrifugation. Confirmer la présence d’une pastille blanche et suspendre à nouveau la pastille en 1 à 5 millilitres de milieu de mammosphère pour le comptage. Ensuite, plaquez les cellules sur des plaques de puits ultra basses traitées par culture non tissulaire six plaques de puits à une concentration moyenne de 2 x 10 à la cinquième cellules viables par millilitre de concentration moyenne de mammosphère pendant une incubation de 7 à 10 jours à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.
À la fin de la culture de 7 à 10 jours, recueillir les mammosphères primaires de chaque puits de la plaque de culture cellulaire et sédimenter les mammosphères par cérifugation. Après avoir décanté le surnatant, utilisez une pipette P200 avec une pointe filtrée pour pipette les mammosphères environ 100 fois. La génération de patients de cellules simples est essentielle pour la quantification précise de la cellule de mammosphère pour une nouvelle labilité.
Inspectez visuellement l’étendue de la ségrégation et utilisez la passoire cellulaire si nécessaire. Suspendre à nouveau les mammosphères dissociées avec 1 à 5 millilitres de milieu de mammosphère fraîche pour compter et plaque 2 X 10 aux quatrièmes cellules viables par millilitre sur l’adhérence ultra faible enrobée de polyhème six plaques de puits pour une culture de 5 à 7 jours. Ensuite, après 5 à 7 jours, compter le nombre de sphères par puits.
À la fin de chaque passage, utilisez un appareil photo numérique monté sur un stéréoscope pour scanner toute la surface de tous les puits pour imager les sphères. Après avoir sauvé les images, sous forme de fichiers tif, importez les images stéréoscope comme séquence d’image dans ImageJ et réglez l’échelle et le type d’image en 8 bits. Dupliquez la pile d’images et sélectionnez L’arrière-plan soustraire de l’onglet Processus.
Vérifiez l’arrière-plan light et les options paraboloïdes coulissantes et cliquez sur OK pour traiter toutes les images de la pile. Sélectionnez Ajuster et seuilr à partir de l’onglet Image et cliquez sur appliquer. Une fenêtre pop up apparaîtra.
Sélectionnez Par défaut comme méthode et lumière comme arrière-plan. Cochez le seuil calculer pour chaque boîte d’images et cliquez sur OK. Pour traiter toutes les images de la pile, sélectionnez Watershed et cliquez sur Oui. Sélectionnez Ouvrir et cliquez sur Oui et sélectionnez Erode et cliquez sur Oui.
Ensuite, sélectionnez Analyser les particules du menu Analyser et définissez le seuil de taille minimum à 10 000 micromètres au carré et la circularité entre 0,50 et 1,00. Sélectionnez l’option Ellipses dans le menu Afficher déposer et vérifier Résumer, Exclure sur les bords, et In situ Afficher. Cliquez ensuite sur OK pour traiter toutes les images de la pile.
Pour calculer la courbe de croissance cumulative pour chaque passage, enregistrez le nombre de cellules plaquées et le nombre de cellules dans les sphères comptées par puits et calculez la taille de la sphère à la fin de chaque passage. Inférer le nombre de sphères plaquées, en divisant le nombre de cellules plaquées pour chaque passage par la taille de la sphère calculée à la fin du passage précédent. Calculer le nombre cumulatif de cellules pour chaque puits par passage et le nombre cumulatif de sphères pour chaque puits par passage et tracer les points de données sur une échelle semi-logarithmique.
Puis une ligne de tendance exponentielle vers les points de données et calculer le coefficient de détermination pour mesurer la bonté de l’ajustement. Ensuite, dépeindre l’équation de la ligne de tendance comme une fonction exponentielle naturelle pour déduire le taux de croissance de la culture. Dans cette expérience, la sphère et le nombre de cellules de cinq passages consécutifs, pour trois expériences indépendantes ont été déterminés.
Ici, à la cellule cumulative et numéros de sphère par passage sont affichés. Comme l’a observé l’activation myc, conduit à une augmentation des taux de croissance de la sphère et des cellules. Les points de temps biologiques et pertinents peuvent être sélectionnés pour la collecte cellulaire ou pour effectuer une analyse de l’expression génétique ou d’autres actifs fonctionnels afin d’évaluer la différenciation cellulaire, la migration et l’invasion.
Il s’agit d’une approche simple et rentable avec de multiples applications. Par exemple, il peut être utilisé dans la découverte directe pour mesurer les effets sur la prolifération des cellules souches cancéreuses et l’auto-renouvellement.
