したがって、mmmosphere培養は、自己更新および分化能力を含む、がん乳房幹細胞行動における正常な重要な側面を研究し、解剖するための簡単にアクセスできる運動システムを提供する。定量的アプローチは、マンモスフィア培養の成長率を客観的に評価し、異なる細胞の種類と条件を直接比較することを目的としています。最初の試験では、消化を避け、各めっきの前に正確な細胞数を確保するために、インキュベーション時間を厳しく管理することをお勧めします。
シャロレーズ・ブルとの手順を実証するのは、私の研究室の技術者であるエリコ・デリアです。4つの腹部および下部胸部マンモリー腺を5〜30、8〜10週齢の雌マウスから収穫した後、DPBSの最小体積で100ミリメートルシャーレあたり最大20腺を配置する。組織を小さな部分にミンチし、断片に10ミリリットルの消化培地を加えます。
25ミリリットルの血清ピペットを使用して、組織片を50ミリリットルの円錐状チューブに移し、パラフィンフィルムでチューブを密封します。その後、0.03 X Gで0.03 X Gで、37度で2時間半、湿度で5%の二酸化炭素をインキュベートします。インキュベーションの終わりに、すべての断片がP1000ピペット先端を通過できる場合、遠心分離によって組織スラリーを沈降し、上清を慎重にデカントする。
3ミリリットルのPBSでペレットを再び懸濁し、100、170、140マイクロメートルのセルストレーナーを通してチューブの内容物を順次濾過して新しい円錐形チューブに入れ、各フィルターの後に2ミリリットルの新鮮なDPBSで各ストレーナーを洗浄します。ペレットは遠心分離により細胞をデカントし、残りのDPBS内の細胞を再懸濁する。同量の塩化アンモニウムカリウムリシスバッファーと細胞を混合し、氷上の赤血球を最大5分間リセリングします。
インキュベーションの終わりに、10ミリリットルのDPBSで溶菌を逮捕し、遠心分離によって細胞を採取する。白いペレットの存在を確認し、カウント用の1〜5ミリリットルのmmosphere培地中にペレットを再び懸濁させる。その後、細胞を非組織培養処理された超低接着6つのウェルプレートに2 x 10から5番目の生存細胞のミンモスフィア培地濃度でプレートをプレートし、摂氏37度と5%の二酸化炭素で7〜10日のインキュベーションを行います。
7〜10日培養の終わりに、細胞培養板の各ウェルから一次のmmosphereを収集し、セチフィケーションによってmmmmospheresを沈下する。上清をデカントした後、P200ピペットをフィルターチップで使用し、約100回のミペットをマムモスフィアにします。単一細胞患者の生成は、新しい可起性のために、mmosphere細胞の正確な定量化に不可欠である。
分離の範囲を視覚的に検査し、必要に応じて細胞ストレーナーを使用します。再は、5〜7日間培養のためにポリヘマコーティングされた6つのウェルプレート上のミリリットル当たり4番目の生存細胞に2 X 10を数える新鮮なマンモスフィア培地の1〜5ミリリットルで不関連のマンモスフィアを再中断する。次に、5~7日後に、ウェル当たりの球数をカウントします。
各通路の最後に、ステレオスコープに取り付けられたデジタルカメラを使用して、すべての井戸の表面全体をスキャンして球体を画像化します。イメージを tif ファイルとして保存した後、ステレオスコープイメージを ImageJ にイメージシーケンスとして読み込み、画像のスケールと種類を 8 ビットに設定します。画像のスタックを複製し、[プロセス]タブから[背景を減算]を選択します。
[背景の明るさ] オプションと [放物線のスライディング] オプションをオンにし、[OK] をクリックしてスタックのすべてのイメージを処理します。[イメージ] タブの [調整としきい値] を選択し、[適用] をクリックします。ポップアップ ウィンドウが表示されます。
方法として[デフォルト]を、[背景]として[ライト]を選択します。[各イメージのしきい値を計算] チェックボックスをオンにして、[OK] をクリックします。スタック内のすべての画像を処理するには、[集水域] を選択して [はい] をクリックします。[開く] を選択し、[はい] をクリックして [Erode] を選択し、[はい] をクリックします。
次に、[解析]メニューから[パーティクルを解析]を選択し、最小サイズしきい値を 10,000 マイクロメートル、0.50 ~ 1.00 の間で[円形]に設定します。[表示] ドロップダウン メニューから [省略記号] オプションを選択し、[要約]、[エッジ上で除外]、および [インザス]表示をオンにします。次に、[OK] をクリックして、スタックのすべてのイメージを処理します。
各通路の累積成長曲線を計算するには、めっき細胞の数とウェル当たりの球数を登録し、各通路の終点で球体サイズを計算する。めっき球の数を推定し、各通過に対してめっきされた細胞の数を、前の通路の終わりに計算された球体サイズで割ることにより。各通過のウェルの累積セル数と、各通過当たりのウェルの累積球数を計算し、データポイントを半対数スケールでプロットします。
次に、指数傾向線をデータポイントに対して計算し、適合度を測定するための決定係数を計算します。次に、トレンドラインの方程式を自然な指数関数として表現し、文化の成長率を推定します。本実験では、5つの連続した通路の球数および細胞数について、3つの独立した実験について、決定した。
ここでは、1節当たりの累積セル数と球数を示します。観察されたMyc活性化として、球および細胞の増殖速度の増加をもたらす。生物学的および関連する時点は、細胞の収集のために、または細胞の分化、移動、および浸潤を評価するために遺伝子発現解析または他の機能資産を実行するために選択することができる。
これは、複数のアプリケーションを使用したシンプルでコスト効率の高いアプローチです。例えば、がん幹細胞増殖や自己再生に対する影響を測定するために直接発見に使用することができる。
