אז תרבויות mammosphere לספק מערכת מוטורית נגישה בקלות ללמוד ול לנתח היבטים חשובים של נורמלי בהתנהגויות סרטן תאי גזע השד, כולל היכולת שלהם לחדש את עצמם ולהבדיל. הגישה הכמותית שלנו שואפת להערכת קצב הצמיחה של תרבויות הממוספרה באופן אובייקטיבי, ומאפשרת השוואה ישירה של סוגי תאים ותנאים שונים. לניסוי הראשון, הייתי ממליץ לשמור על שליטה הדוקה על זמני הדגירה כדי למנוע עיכול יתר ולהבטיח ספירת תאים מדויקת לפני כל ציפוי.
מדגים את ההליך עם שרוך בול יהיה Errico D'Elia, טכנאי מהמעבדה שלי. לאחר קצירת ארבע בלוטות החלב בטן ובית החזה התחתון מ 5 עד 30, 8 עד 10 עכברים נקבה בשבוע, מניחים עד 20 בלוטות לכל צלחת פטרי 100 מילימטר בנפח מינימלי של DPBS. טחון את הרקמות לחתיכות קטנות יותר ולהוסיף 10 מיליליטר של מדיום העיכול לרסיסים.
השתמש פיפטה סרולוגית 25 מיליליטר כדי להעביר את חתיכות הרקמה לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר ולאטום את הצינור עם סרט פרפין. לאחר מכן הדגירה את השברים על מסובב ב 0.03 X G במשך 2 1/2 שעות ב 37 מעלות ו 5% פחמן דו חמצני עם לחות. בסוף הדגירה, אם כל השברים ניתן להעביר דרך קצה פיפטה P1000, משקעים את תרחיף הרקמה על ידי צנטריפוגה בזהירות decant העל טבעי.
להשעות מחדש את גלולה ב 3 מיליליטר של PBS ולסנן את תכולת הצינור ברצף דרך אחד 100, 170, 140 מיקרומטר מאמץ התא לתוך צינור חרוט חדש, לשטוף כל מסננת עם 2 מיליליטר של DPBS טרי לאחר כל מסנן. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ו decant re supernatant השעיית התאים ב DPBS הנותרים. מערבבים את התאים עם נפח שווה של מאגר אשלגן אשלגן אמוניום כלורי lyse תאי הדם האדומים על הקרח עד 5 דקות.
בסוף הדגירה, לעצור את תמוגה עם 10 מיליליטר של DPBS ולאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה. אשר את נוכחותו של גלולה לבנה ולהשעות מחדש את גלולה ב 1 עד 5 מיליליטר של מדיום mammosphere לספירה. לאחר מכן צלחת התאים על תאים שאינם רקמה תברית מטופלים הידבקות נמוכה במיוחד שש צלחות גם ב 2 x 10 לתאים קיימא החמישי לכל מיליליטר של ריכוז בינוני mammosphere עבור דגירה 7 עד 10 יום ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני.
בסוף תרבות 7 עד 10 הימים, לאסוף את mammospheres העיקרי מכל באר של צלחת תרבות התא ומנחה את mammospheres על ידי cetrifugation. לאחר decanting את supernatant, להשתמש פיפטה P200 עם קצה מסונן כדי pipette את mammospheres כ 100 פעמים. הדור של חולים תאים בודדים הוא קריטי לכימות מדויק של התא mammosphere עבור lability חדש.
בדיקה חזותית של מידת ההפרדה ולהשתמש מסננת התא במידת הצורך. להשעות מחדש את mammospheres משויך עם 1 עד 5 מיליליטר של מדיום mammosphere טרי לספירה צלחת 2 X 10 לתאים קיימא הרביעי למיליליטר על הידבקות נמוכה במיוחד פוליהמה שש צלחות גם לתרבות 5 עד 7 ימים. לאחר מכן, לאחר 5 עד 7 ימים, לספור את מספר הכדורים ל באר.
בסוף כל קטע, השתמש במצלמה דיגיטלית המותקנת על סטריאוסקופ כדי לסרוק את כל פני השטח של כל בארות כדי לצלם את הכדורים. לאחר שמירת התמונות, כקובצי tif, יבאו את תמונות הסטריאוסקופ כרצף תמונות ל-ImageJ והגדירו את קנה המידה ואת סוג התמונה ל- 8 סיביות. שכפלו את ערימת התמונות ובחרו 'חיסור רקע' מהטאב 'תהליך'.
בדוק את האפשרויות רקע בהיר ופרבולואיד הזזה ולחץ על אישור כדי לעבד את כל התמונות של הערימה. בחרו 'התאם' ו'סף' מהטאב 'תמונה' ולחצו על 'החל'. יופיע חלון מוקפץ.
בחר באפשרות ברירת מחדל כשיטה ואור כ' רקע'. סמן את התיבה חשב סף עבור כל תמונה ולחץ על אישור. לעיבוד כל התמונות בערימה, בחרו 'קו פרשת מים' ולחצו על 'כן'. בחר פתח ולחץ על כן ובחר שחק ולחץ על כן.
לאחר מכן, בחר נתח חלקיקים מתפריט ניתוח והגדר את סף הגודל המינימלי ב- 10,000 מיקרומטר בריבוע ואת המעגליות בין 0.50 ל- 1.00. בחרו באפשרות 'אליפסות' מהתפריט הנפתח 'הצג' ובדקו 'סיכום', 'אל תכלול בקצוות' ו'הצג במקום'. לאחר מכן לחצו על הלחצן 'אשר' כדי לעבד את כל התמונות של הערימה.
כדי לחשב את עקומת הגדילה המצטברת עבור כל מעבר לרשום את מספר התאים המ מצופים ואת מספר התאים בכדורים שנספרו לאורך ולחשב את גודל הכדור בסוף כל מעבר. להסיק את מספר הכדורים מצופים, על ידי חלוקת מספר התאים מצופים עבור כל מעבר על ידי גודל הכדור מחושב בסוף המעבר הקודם. חשב את מספר התא המצטבר עבור כל באר לכל מעבר ואת מספר הכדור המצטבר עבור כל באר לכל מעבר והתוות את נקודות הנתונים בסולם לוגריתמי למחצה.
לאחר מכן קו מגמה אקספוננציאלי לנקודות הנתונים ולחשב את מקדם הנחישות כדי למדוד את טובת מתאים. לאחר מכן לתאר את המשוואה של קו המגמה כפונקציה מעריכית טבעית להסיק את קצב הצמיחה של התרבות. בניסוי זה נקבעו ספירה ומספרי תאים של חמישה קטעים רצופים, עבור שלושה ניסויים עצמאיים.
כאן מוצגים מספרי התאים והמספרים המצטברים לכל מעבר. כפי שנצפה Myc ההפעלה, מוביל גדל ספירה וצמיחת תאים שיעורי הצמיחה. ניתן לבחור נקודות זמן ביולוגיות ורלוונטיות לאיסוף תאים או לביצוע ניתוח ביטוי גנים או נכסים פונקציונליים אחרים כדי להעריך את ההתברמות, ההגירה והפלישה לתאים.
זוהי גישה פשוטה וחסכונית עם יישומים מרובים. לדוגמה, ניתן להשתמש בו בגילוי ישיר כדי למדוד את ההשפעות על התפשטות תאי גזע סרטניים והתחדשות עצמית.
