Las células HC11 y EpH4 son líneas celulares epiteliales mamarias de ratón que pueden diferenciarse en el cultivo. Al mismo tiempo, estas células pueden ser transformadas por un número de oncogenes. Estas células son ideales para el estudio de la interrelación entre la diferenciación y la transformación neoplásica.
Estas técnicas se pueden utilizar en estudios de transducción de señales para descubrir objetivos para la terapia contra el cáncer. Por ejemplo, la pequeña GTPase Rac y otras moléculas pueden desencadenar la transformación de las células epiteliales mamarias cuando se expresan a niveles altos, pero sorprendentemente a niveles bajos, pueden inducir la diferenciación. Otros transductores de señal pueden comportarse de manera similar.
Los principios pueden aplicarse a otros tipos de diferenciación, así cuando la confluencia celular juega un papel importante, por ejemplo la diferenciación de adipocitos o miotubos. Alguien que realiza esta técnica por primera vez debe tener en cuenta que el revestimiento de las células HC11 es importante. Esto se debe a que el contacto de celda a célula es importante para la diferenciación.
Otro punto a tener en cuenta es que la extracción adecuada de células EpH4 de la matriz es crítica para la cuantificación de proteínas porque cualquier residuo afectará la determinación de proteínas. La demostración visual de este método es útil porque algunos detalles del protocolo son difíciles de describir en papel. Comience preparando una botella de 50 mililitros de medio celular HC11 de acuerdo con las instrucciones del manuscrito.
Para placar las células, aspirar el medio de cinco platos de Petri de seis centímetros 50% confluentes y lavar las células con aproximadamente 1,8 mililitros de tripina utilizando una pipeta Pasteur estéril de algodón de nueve pulgadas enchufada. Luego agregue 200 microlitros de trippsina por placa y gire la placa para desalojar las células conectadas. Observe la microscopía de contraste de las células bajo fase con un objetivo 4X para asegurarse de que han comenzado a desalojarse.
Luego aspirar aproximadamente 1,5 mililitros de hc11 medio con una pipeta Pasteur estéril de nueve pulgadas y chorro verticalmente contra las células mientras gira el plato asegurándose de evitar salpicaduras. Transfiera todas las células al frasco con HC11 medio y arremolina para dispersarse uniformemente en el frasco. Luego aliquot la suspensión celular en 20 tres centímetros Petri platos por pipetear dos mililitros de células por plato.
Mece los platos de Petri para esparcir las células e incubarlas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante la noche. Al día siguiente, cuando las células sean de 90 a 100% confluentes, aspire el medio y reemplácelo por medio con FBS pero sin EGF. Después de cultivar las células en medio sin EGF durante 24 horas, añadir el medio de diferenciación a 10 platos y cultivar las células durante un máximo de 10 días manteniendo los otros 10 platos como controles.
Cambie el medio cada dos o tres días con las células tratadas con HIP y de control. Para monitorear la diferenciación, observe las células con microscopía de contraste de fase. Utilice microscopía de fluorescencia si las células expresan proteína fluorescente verde.
Además, cuantificar el grado de diferenciación mediante la extracción de proteínas de las células tratadas y de control de HIP una vez al día y la realización de análisis de Western Blot. Reúna y coloque el medio de crecimiento EpH4, la matriz EHS y dos tubos cónicos de 50 mililitros sobre hielo. Precaer las placas de cultivo de tejido con puntas de pipeta a menos 20 grados Celsius y preparar el medio de crecimiento EpH4 complementado con matriz de 10 o 20% en dos tubos cónicos de 50 mililitros y mantenerlos en hielo hasta que estén listos para usar.
Después de recuperar las placas de cultivo de tejido prechilled a menos 20 grados Celsius, cubra 10 pozos de la placa de 24 pozos con 150 microlitros de matriz sin diluir esparciendo la matriz con una pipeta. Evite crear burbujas al esparcir la matriz. A continuación, toque suavemente los lados de la placa e incubar la placa a 37 grados Celsius durante una hora para permitir que la matriz se solidifique.
Mientras tanto, prepárese para la diferenciación mediante la trippsina de las células EpH4, así como se describió previamente y asegurando suspensiones de una sola célula después de la resuspensión de las células trippsinas. A continuación, cuente las células en suspensión con un hemocicómetro. Transfiera cinco veces 10 a las cuatro células por pozo a un tubo de centrífuga cónica estéril de 1,5 mililitros y gíselas a 250 veces g durante cinco minutos.
Aspirar cuidadosamente el medio sobrenadante y colocar el tubo sobre hielo. Utilice una punta de pipeta de un mililitro para resuspender las células en 350 microlitros del medio de crecimiento EpH4 complementados con matriz de 20%mientras mantiene los tubos en hielo asegurándose de evitar burbujas. Una vez que la capa inferior se haya solidificado, agregue los 350 microlitros de suspensión celular a cada pozo recubierto y colóquelo en una incubadora de dióxido de carbono a 37 grados Celsius durante una hora para permitir que la capa de matriz del 20% se solidifique.
Observe las células con microscopía de contraste de fase para asegurarse de que las células individuales son visibles. A continuación, añadir 200 microlitros de EpH4 medio con matriz de 10% en la parte superior e incubar la placa a 37 grados Centígrados. Comience la inducción de diferenciación un día después de encoar las células en la matriz.
Retire cuidadosamente 150 microlitros de 10% medio de matriz superior y agregue 200 microlitros de medio EpH4 que contengan HIP y matriz del 10% y para los controles agregue un medio de matriz del 10% sin HIP. Sustituya el medio cada dos días durante un máximo de 10 días de monitorización de la formación de la mamosfera por microscopía de contraste de fase. Para cuantificar la diferenciación, pipetee cuidadosamente el medio HIP de 10%matriz de los pozos y enjuague la capa de matriz del 20% con 350 microlitros de PBS frío.
A continuación, agregue de 70 a 100 microlitros de PBS helado con un EDTA mililolar directamente en los pozos y desenganche suavemente la capa inferior de 100% matriz con una punta de pipeta. Agitar suavemente el plato a cuatro grados centígrados durante 30 minutos. Transfiera cuidadosamente la suspensión del esferoide a un tubo cónico y enjuague los pozos con 500 microlitros de PBS EDTA para recuperar los esferoides restantes.
Mece el tubo sobre hielo durante 30 minutos adicionales asegurándose de que la matriz se disuelva por completo. Si se ven grumos de matriz visible, agregue más PBS EDTA o agite más tiempo. Centrifugar la solución a 350 veces g para peletizar los esferoides.
A continuación, aspirar el sobrenadante,lyse los esferoides, y sondear las células para beta-caseína, ciclina D1, y p120RasGAP por hinchazón occidental. Hay una sorprendente dependencia de la diferenciación sobre la fuerza de la señal Rac en las células HC11. Mientras que el CRAC1 endógeno es necesario para la diferenciación y los bajos niveles de RacV12 activado mutacionalmente causan un aumento en la capacidad de diferenciación, los altos niveles de RacV12 desencadenan un bloque de diferenciación e inducen neoplasia.
Cuando se exploraron las propiedades de diferenciación de las células EpH4 en un cultivo de matriz 3D, se encontró que la producción de beta-caseína alcanzó un máximo de ocho a 10 días y la expresión de la ciclina D1 fue máxima a los cuatro a seis días después de la estimulación hip. Para determinar el posicionamiento de las células individuales, se teñiron con DAPI y se tomaron imágenes con microscopía confocal. La muerte celular interna y la formación de lúmenes huecos se observaron en las mamosferas, mientras que la adición de HGF dio lugar a la formación de estructuras tubulares.
Alguien que realiza esta técnica por primera vez debe tener en cuenta que el revestimiento de las células HC11 es importante. También la extracción adecuada de las células EpH4 de la matriz es fundamental para la cuantificación de proteínas porque cualquier residuo afectará la determinación de proteínas. Esta técnica se puede utilizar para investigar otros transductores de señal que pueden comportarse de manera similar.
Si hay mutaciones del conductor en un cáncer, entonces su inhibición completa no será necesaria ya que los niveles bajos restantes realmente inducirían la diferenciación.
