Le attuali misure cliniche di rilevamento del cancro alle ovaie sono aspecifiche e mancano di rilevamento del punto di cura delle cellule tumorali circolanti. Il nostro sistema di flusso fotoacustico consente di testare campioni di pazienti per specifici marcatori di cancro alle ovaie nel flusso sanguigno. Questa procedura fornisce una tecnologia di piattaforma unica con miglioramenti rispetto alle tecniche attuali in termini di semplicità, basso costo, limiti promettenti di rilevamento e capacità di essere applicata ad applicazioni generali.
Attraverso questo lavoro, miriamo a costruire il nostro sistema di nanoparticelle mirate per il cancro alle ovaie per testare campioni di pazienti ex vivo per cTC. Questo sistema PAFC altamente versatile è in grado di espandersi per uso clinico, testando la presenza di una vasta gamma di biomarcatori nel sangue. Un corretto allineamento ottico è fondamentale per il rilevamento di bersagli all'interno del sistema di citometria a flusso fotoacustico.
Inoltre, per garantire un corretto accoppiamento acustico, assicurarsi che non vi siano bolle tra il vetrino e il trasduttore. A causa della natura personalizzata del sistema di flusso e dei suoi componenti, la visualizzazione del metodo è utile per una riproduzione accurata. In una cappa aspirante chimica ventilata, filtrare circa 300 millilitri di acqua deionizzata attraverso un filtro sterile da 0,2 micrometri.
Aggiungere 0,0134 grammi di cloruro di rame e 100 millilitri di acqua deionizzata a un pallone inferiore rotondo pulito da 250 millilitri per creare una soluzione di cloruro di rame millimolare. Aggiungere 0,015 grammi di acido folico al pallone e utilizzare una barra di agitazione magnetica per mescolare la soluzione per circa cinque minuti. Quindi mescolare 0,024 grammi di solfuro di sodio nonaidrato con 100 microlitri di acqua deionizzata.
Utilizzare una pipetta da 200 microliter per aggiungere lentamente questa soluzione alla miscela di reazione per una durata di circa 10 secondi. Cap il recipiente di reazione. Posizionare la nave in un bagno d'olio impostato a 90 gradi Celsius e continuare a mescolare.
Dopo circa 15 minuti o quando il bagno d'olio ha raggiunto l'intervallo di temperatura compreso tra 85 e 90 gradi Celsius, consentire alla reazione di procedere per un'ora aggiuntiva. Al termine della reazione, rimuovere il recipiente di reazione dal bagno d'olio e lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente per 10-15 minuti prima di trasferirlo in un bagno di ghiaccio. Una volta raffreddata la reazione, regolare il pH a circa 10 utilizzando un idrossido di sodio molare.
Aggiungere la miscela a una colonna di centrifugazione di 30 kilodalton in lotti da 15 millilitri e centrifugare a 3.082 volte g per 15 minuti per purificare la miscela di reazione. In primo luogo, mescolare le nanoparticelle di solfuro di rame chiuso con acido folico alla giusta concentrazione nei mezzi RPMI freschi. Aggiungere questa soluzione di nanoparticelle ad ogni pozzo della piastra preparata a 24 pozzetti che contiene cellule SK-OV-3 ad una concentrazione di 400 microgrammi per millilitro.
Incubare a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% per due ore. Successivamente, tripinare le cellule con 0,5 millilitri dello 0,25% di tripside e EDTA. Per neutralizzare la tripsiderina, aggiungere almeno un millilitro di RPMI 1640 privo di acido folico e centrifugare le cellule a 123 volte g per sei minuti.
Per lavare le cellule, rimuovere il supernatante, rimescolare le cellule in due millilitri di PBS e centrifugare a 123 volte g per sei minuti. Ripetere questo passaggio di lavaggio due volte per rimuovere eventuali nanoparticelle non vincolate. Quindi rimospendare le celle con uno o due millilitri di una soluzione di interpolazione del 2% in PBS.
Contare le cellule usando un emocitometro e Trypan Blue. Diluire le cellule in una soluzione del 2%Tween in PBS alla concentrazione scelta per il rilevamento. Utilizzare il file STL tridimensionale fornito per stampare in 3D il serbatoio di flusso con termoplastica ABS o plastica PLA.
Dopo aver stampato il serbatoio, pulire e assemblare il sistema per l'uso. Posizionare le coperture in vetro sopra lo slot di un millimetro per tre millimetri e il foro di un centimetro nel sistema di flusso e sigillare con cura con silicone per evitare perdite. Quindi, inserire il tubo capillare nei tubi polimerizzati in silicone.
Inserire i tubi nella camera di flusso attraverso il lato del serbatoio di flusso in modo che il tubo capillare in vetro sia direttamente sopra e davanti alla fessura di tre millimetri e al foro di un centimetro. Sigillare il tubo con silicone. Quindi collegare il trasduttore a un pulser e ricevitore ad ultrasuoni.
Amplifica il segnale con un guadagno di 59 decibel. Collegare l'output del filtro a un oscilloscopio riconfigurabile multifunzione dotato di un array di gate programmabile sul campo incorporato. Collegare uno dei tubi provenienti dalla camera di flusso a una giunzione a T collegata a due pompe per siringhe in ogni ramo.
Riempire una delle pompe della siringa con aria e l'altra pompa con il campione da analizzare. Impostare la pompa contenente aria su una portata di 40 microlitri al minuto e impostare la pompa contenente il campione su una portata di 20 microlitri al minuto. Quindi, collegare il tubo rimanente che esce dal sistema di flusso a un contenitore di candeggina al 10% per smaltire le celle dopo l'uscita dal sistema di flusso.
Posizionare la sezione del tubo capillare al quarzo in diretto allineamento con il trasduttore nella vista sul campo del microscopio per consentire un attento posizionamento della fibra ottica sopra il campione in modo che illumini l'intera larghezza del tubo. Irradiare il campione utilizzando una fibra ottica che incanala un laser a stato solido pompato a diodi che opera ad una lunghezza d'onda di 1.053 nanometri. Utilizzare una fotocamera montata al microscopio per registrare il flusso, la cottura del laser e il passaggio dei campioni attraverso il sistema di flusso.
In questo studio, la citometria a flusso fotoacustico e l'agente mirato di targeting del solfuro di rame sono usati per rilevare le cellule tumorali circolanti ovariane. Una tipica immagine TEM delle nanoparticelle sintetizzata mostra che la dimensione media di una nanoparticella tipica è di circa 8,6 nanometri. I diametri orizzontali e verticali di ogni particella vengono quindi misurati perpendicolarmente l'uno all'altro e ulteriormente mediati.
Il diametro idrodinamico medio per queste particelle è di 73,6 nanometri. Le nanoparticelle di solfuro di rame hanno una caratteristica curva di assorbanza che si estende nel vicino infrarosso. C'è un leggero manufatto di circa 850 nanometri causato dalla commutazione dei laser da parte dello spettrofotometro.
Le immagini della microscopia a fluorescenza di cellule incubate con nanoparticelle contrassegnate fluorescentmente mostrano che l'assorbimento delle nanoparticelle può essere visualizzato dalla presenza di fluorescenza attraverso la cellula. Le cellule non incubate con nanoparticelle non mostrano alcun segnale fluorescente. La presenza di questo segnale fluorescente indica il successo dell'assorbimento delle particelle e la loro capacità di essere rilevate nel sistema di flusso.
Esempi di segnali tipici di acquisizione dati sono mostrati qui. I dati grezzi indicano le differenze di segnale tra le nanoparticelle taggate cellule, PBS, e l'acido folico limitato nanoparticelle di solfuro di rame. Utilizzando la vista di laboratorio personalizzata e il software MATLAB, le ricostruzioni delle immagini sono fatte dei controlli positivi e negativi rispettivamente in tempo reale e dopo l'acquisizione.
I singoli inviluppi vengono successivamente convertiti in valori di pixel e visualizzati come colonne indipendenti. Chiare differenze nel segnale fotoacustico si verificano tra pbs e le nanoparticelle di solfuro di rame con limitato acido folico ad una concentrazione di 100 microgrammi per millilitro. Durante questa procedura, è fondamentale allineare correttamente il trasduttore ad ultrasuoni, il microscopio e la fibra ottica all'interno del sistema di citometria a flusso fotoacustico.
Confermare l'allineamento del sistema testando i controlli positivi e negativi. Grazie alla versatilità delle tecniche di targeting fotoacustico e all'ampia gamma di applicazioni possibili utilizzando PAFC, questa tecnica apre la strada ad applicazioni cliniche e di ricerca di importanza traslazionistica. Per garantire l'applicazione clinica, ulteriori studi dovrebbero concentrarsi sul test dei campioni di pazienti e sulla riduzione delle fasi procedurali.
La sintesi delle nanoparticelle dovrebbe avvenire in una cappa aspirante chimica utilizzando i dispositivi di protezione adeguati. Le linee cellulari umane devono essere gestite secondo le linee guida dell'istituto. L'uso del laser richiede un addestramento alla sicurezza delle radiazioni e DPI appropriati.
L'uso del laser e i test fotoacustici devono essere eseguiti solo da personale altamente qualificato.
