Détection du cancer de l'ovaire à l'aide de la cytométrie du flux photoacoustique

Les mesures cliniques actuelles de détection du cancer de l’ovaire ne sont pas spécifiques et manquent de détection du point de soins des cellules tumorales circulantes. Notre système d’écoulement photoacoustique permet de tester des échantillons de patients pour des marqueurs spécifiques du cancer de l’ovaire dans le flux sanguin. Cette procédure fournit une technologie de plate-forme unique avec des améliorations par rapport aux techniques actuelles en termes de simplicité, faible coût, des limites prometteuses de détection, et la capacité d’être appliquée à des applications larges.

Grâce à ces travaux, nous visons à construire à partir de notre système de nanoparticules ciblées pour le cancer de l’ovaire pour tester des échantillons ex vivo patient pour les CTC. Ce système PAFC hautement polyvalent est capable de se développer pour un usage clinique, testant la présence d’un large éventail de biomarqueurs dans le sang. Un alignement optique approprié est essentiel à la détection des cibles dans le système photoacoustique de cytométrie du débit.

De plus, pour assurer un couplage acoustique adéquat, assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles entre la glissière de verre et le transducteur. En raison de la nature personnalisée du système d’écoulement et de ses composants, la visualisation de la méthode est bénéfique pour une reproduction précise. Dans un capot de fumée chimique ventilé, filtrer environ 300 millilitres d’eau déionisée à travers un filtre stérile de 0,2 micromètre.

Ajouter 0,0134 gramme de chlorure de cuivre et 100 millilitres d’eau déionisée à un flacon de fond rond propre de 250 millilitres pour créer une solution de chlorure de cuivre d’un millimlaire. Ajouter 0,015 gramme d’acide folique au flacon et utiliser une barre magnétique pour mélanger la solution pendant environ cinq minutes. Mélanger ensuite 0,024 gramme de sulfide de sodium nonhydrate avec 100 microlitres d’eau déionisée.

Utilisez une pipette de 200 microlitres pour ajouter lentement cette solution au mélange de réaction sur une durée d’environ 10 secondes. Cap le vaisseau de réaction. Placez le navire dans un bain d’huile réglé à 90 degrés Celsius et continuez à remuer.

Après environ 15 minutes ou lorsque le bain d’huile a atteint la plage de température entre 85 et 90 degrés Celsius, permettre à la réaction de procéder pendant une heure supplémentaire. Lorsque la réaction est terminée, retirez le récipient de réaction du bain d’huile et laissez-le refroidir à température ambiante pendant 10 à 15 minutes avant de le transférer dans un bain de glace. Une fois la réaction refroidie, réglez le pH à environ 10 à l’aide d’un hydroxyde de sodium molaire.

Ajouter le mélange à une colonne de centrifugation de 30 kilodaltons en lots de 15 millilitres et centrifugeuse à 3 082 fois g pendant 15 minutes pour purifier le mélange de réaction. Tout d’abord, mélanger les nanoparticules de sulfure de cuivre plafonnées à l’acide folique à la bonne concentration dans les médias RPMI frais. Ajoutez cette solution nanoparticule à chaque puits de la plaque préparée de 24 puits qui contient des cellules SK-OV-3 à une concentration de 400 microgrammes par millilitre.

Incuber à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant deux heures. Après cela, trypsiniser les cellules avec 0,5 millilitres de 0,25% trypsine et EDTA. Pour neutraliser la trypsine, ajouter au moins un millilitre de RPMI 1640 sans acide folique et centrifuger les cellules à 123 fois g pendant six minutes.

Pour laver les cellules, enlever le supernatant, résuspendre les cellules en deux millilitres de PBS et centrifugeuse à 123 fois g pendant six minutes. Répétez cette étape de lavage deux fois pour enlever les nanoparticules non liées. Puis résuspendez les cellules avec un à deux millilitres d’une solution 2%Tween dans PBS.

Comptez les cellules à l’aide d’un hémomètre et trypan bleu. Diluer les cellules dans une solution de 2%Tween dans PBS à la concentration choisie pour la détection. Utilisez le fichier STL tridimensionnel fourni pour imprimer en 3D le réservoir d’écoulement avec du plastique thermoplastique ABS ou PLA.

Après avoir imprimé le réservoir, nettoyez et assemblez le système pour l’utiliser. Placez les couvercles en verre sur la fente d’un millimètre par trois millimètres et le trou d’un centimètre dans le système d’écoulement et scellez soigneusement avec du silicone pour éviter les fuites. Ensuite, placez le tube capillaire dans les tubes durcis au silicone.

Insérez les tubes dans la chambre d’écoulement par le côté du réservoir d’écoulement de sorte que le tube capillaire en verre soit directement au-dessus et devant la fente de trois millimètres et le trou d’un centimètre. Sceller le tube avec du silicone. Connectez ensuite le transducteur à un pulsateur à ultrasons et à un récepteur.

Amplifiez le signal avec un gain de 59 décibels. Connectez la sortie du filtre à un oscilloscope reconfigurable polyvalent équipé d’un réseau de portes programmables sur le terrain intégré. Connectez l’un des tubes provenant de la chambre d’écoulement à une jonction T qui est reliée à deux pompes à seringues à chaque branche.

Remplissez l’une des pompes à seringues d’air et l’autre pompe avec l’échantillon à analyser. Réglez la pompe contenant de l’air à un débit de 40 microlitres par minute et réglez la pompe contenant l’échantillon à un débit de 20 microlitres par minute. Ensuite, connectez le tube restant sortant du système d’écoulement à un récipient de 10% d’eau de Javel pour éliminer les cellules après leur sortie du système d’écoulement.

Placez la section du tube capillaire de quartz en alignement direct avec le transducteur dans la vue sur le terrain du microscope pour permettre un placement soigneux de la fibre optique au-dessus de l’échantillon de sorte qu’il illumine toute la largeur du tube. Irradier l’échantillon à l’aide d’une fibre optique canaliser un laser à l’état solide pompé par diode fonctionnant à une longueur d’onde de 1053 nanomètres. Utilisez une caméra montée au microscope pour enregistrer le débit, le tir du laser et le passage d’échantillons à travers le système d’écoulement.

Dans cette étude, la cytométrie photoacoustique d’écoulement et l’agent ciblé de ciblage de sulfide de cuivre sont employées pour détecter des cellules de tumeur circulante ovariennes. Une image TEM typique des nanoparticules synthétisées montre que la taille moyenne d’une nanoparticule typique est d’environ 8,6 nanomètres. Les diamètres horizontaux et verticaux de chaque particule sont ensuite mesurés perpendiculairement les uns aux autres et en moyenne.

Le diamètre hydrodynamique moyen de ces particules est de 73,6 nanomètres. Les nanoparticules de sulfure de cuivre ont une courbe d’absorption caractéristique qui s’étend dans le proche infrarouge. Il ya un artefact léger autour de 850 nanomètres qui est causée par le commutation de lasers par le spectrophotomètre.

Les images de microscopie par fluorescence de cellules incubées avec des nanoparticules étiquetées fluorescentes montrent que l’absorption de nanoparticules peut être visualisée par la présence de fluorescence à travers la cellule. Les cellules non incubées avec des nanoparticules ne montrent aucun signal fluorescent. La présence de ce signal fluorescent indique l’absorption réussie des particules et leur capacité à être détectées dans le système d’écoulement.

Des exemples de signaux typiques d’acquisition de données sont affichés ici. Les données brutes indiquent les différences de signal entre les nanoparticules étiquetées cellules, PBS, et l’acide folique plafonné nanoparticules de sulfure de cuivre. En utilisant la vue de laboratoire personnalisée et le logiciel MATLAB, les reconstructions d’images sont faites des contrôles positifs et négatifs en temps réel et après l’acquisition respectivement.

Les enveloppeurs individuels sont ensuite convertis en valeurs pixel et affichés sous forme de colonnes indépendantes. Des différences claires dans le signal photoacoustique se produisent entre PBS et les nanoparticules de sulfure de cuivre plafonnées à l’acide folique à une concentration de 100 microgrammes par millilitre. Au cours de cette procédure, il est essentiel d’aligner correctement le transducteur ultrasons, le microscope et la fibre optique dans le système photoacoustique de cytométrie d’écoulement.

Confirmez l’alignement du système en testant les contrôles positifs et négatifs. En raison de la polyvalence des techniques de ciblage photoacoustique et du large éventail d’applications possibles à l’aide de PAFC, cette technique ouvre la voie à des applications cliniques et de recherche d’importance translation. Pour assurer l’application clinique, d’autres études devraient se concentrer sur l’essai d’échantillons de patients et la réduction des étapes procédurales.

La synthèse des nanoparticules doit avoir lieu dans une hotte de fumée chimique utilisant l’équipement de protection approprié. Les lignées cellulaires humaines doivent être traitées conformément aux lignes directrices de votre établissement. L’utilisation du laser nécessite une formation en radioprotentique et un EPI approprié.

L’utilisation du laser et les tests photoacoustiques ne devraient être effectués que par du personnel hautement qualifié.