현재 임상 난소암 검출 조치는 순환 종양 세포의 비특이적이고 치료 감지 지점이 부족하다. 당사의 광음향 유량 시스템은 혈류의 특정 난소암 마커에 대한 환자 샘플을 테스트할 수 있습니다. 이 절차는 단순성, 저렴한 비용, 유망한 탐지 제한 및 광범위한 응용 프로그램에 적용할 수 있는 기능 면에서 현재 기술에 비해 개선된 고유한 플랫폼 기술을 제공합니다.
이 작업을 통해, 우리는 CTC에 대한 전 생체 균 환자 샘플을 테스트하기 위해 난소암에 대한 우리의 표적 나노 입자 시스템의 구축을 목표로하고있다. 이 고도로 다재다능한 PAFC 시스템은 혈액내 의 광범위한 바이오마커의 존재를 테스트하여 임상 사용을 위해 확장할 수 있습니다. 적절한 광학 정렬은 광음향 유량 세포 측정 시스템 내에서 대상을 감지하는 데 매우 중요합니다.
또한 적절한 어쿠스틱 커플링을 보장하기 위해 유리 슬라이드와 트랜스듀서 사이에 거품이 없는지 확인하십시오. 유동 시스템과 그 구성 요소의 사용자 지정 특성으로 인해 이 방법의 시각화는 정확한 재생에 유용합니다. 환기 화학 연기 후드에서 멸균 0.2 마이크로미터 필터를 통해 약 300 밀리리터의 탈온화를 필터링합니다.
0.0134 그램의 구리 염화물과 100 밀리리터의 탈이온된 물을 깨끗한 250 밀리리터 둥근 바닥 플라스크에 추가하여 1 밀리몰러 구리 염화물 용액을 만듭니다. 플라스크에 0.015 그램의 엽산을 추가하고 마그네틱 스터디 바를 사용하여 약 5 분 동안 용액을 혼합하십시오. 그런 다음 0.024 그램의 황화물 나트륨을 100 마이크로리터의 탈화 된 물과 혼합하십시오.
200 마이크로리터 파이펫을 사용하여 약 10초 동안 반응 혼합물에 이 솔루션을 천천히 추가합니다. 반응 용기를 캡. 선박을 섭씨 90도로 설정한 오일 욕조에 넣고 계속 저어줍니다.
약 15분 후 또는 오일 목욕이 섭씨 85도에서 90도 사이의 온도 범위에 도달하면 반응이 1시간 동안 진행되도록 합니다. 반응이 완료되면, 오일 목욕에서 반응 용기를 제거하고 얼음 목욕으로 전송하기 전에 10 ~ 15 분 동안 실온에서 냉각할 수 있습니다. 반응이 냉각되면, 수산화 나트륨 1개를 사용하여 pH를 약 10으로 조정합니다.
혼합물을 30킬로달톤 원심분리 컬럼에 15밀리리터 배치및 원심분리기3, 082배g에 넣고 15분간 반응 혼합물을 정화합니다. 먼저, 엽산 캡구리 황화물 나노입자를 신선한 RPMI 매체에서 적절한 농도로 혼합한다. 이 나노 입자 용액을 밀리리터 당 400 마이크로그램의 농도로 SK-OV-3 세포를 포함하는 준비된 24웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다.
섭씨 37도에서 2시간 동안 이산화탄소 5%를 배양합니다. 그 후, 트립시니화 세포와 함께 0.5 밀리리터0.25%의 트립신과 EDTA. 트립신을 중화하려면 엽산이 없는 RPMI 1640의 적어도 1밀리리터를 추가하고 6분 동안 123배 g의 세포원심분리기를 추가합니다.
세포를 세척하려면, 상체를 제거하고, PBS와 원심분리기의 2밀리리터에서 6 분 동안 123 배 g에서 세포를 다시 분리하십시오. 이 세척 단계를 두 번 반복하여 언바운드 나노 입자를 제거합니다. 그런 다음 PBS에서 2%Tween 용액의 1~2밀리리터로 세포를 다시 일시 중단합니다.
혈전계와 트라이판 블루를 사용하여 세포를 계산합니다. PBS에서 2%Tween의 용액에서 세포를 검출을 위해 선택한 농도로 희석시. 제공된 3차원 STL 파일을 사용하여 ABS 열가소성 플라스틱 또는 PLA 플라스틱으로 유동 탱크를 3D 인쇄합니다.
탱크를 인쇄 한 후 시스템을 청소하고 조립하여 사용할 수 있습니다. 유리 커버립을 1밀리미터 에 3밀리미터 슬롯에 놓고 유동 시스템에 1센티미터 구멍을 배치하고 실리콘으로 조심스럽게 밀봉하여 누출을 방지합니다. 다음으로, 모세관 튜브를 실리콘 경화 튜브에 맞춥시게 한다.
유리 모세관 튜브가 3밀리미터 슬롯과 1센티미터 구멍 바로 위와 앞에 있도록 유동 탱크의 측면을 통해 유량 챔버에 튜브를 삽입합니다. 실리콘으로 튜브를 밀봉합니다. 그런 다음 트랜스듀서를 초음파 펄스기 및 수신기에 연결합니다.
신호를 59 데시벨 게인으로 증폭시다. 필터의 출력을 내장된 현장 프로그래밍 가능한 게이트 어레이가 장착된 다목적 재구성 가능한 오실로스코프에 연결합니다. 유동 챔버에서 나오는 튜브 중 하나를 각 분기의 두 개의 주사기 펌프에 연결된 T 접합부에 연결합니다.
주사기 펌프 중 하나를 공기로 채우고 다른 펌프는 분석할 샘플과 함께 채웁니다. 공기를 함유하는 펌프를 분당 40 마이크로리터의 유량으로 설정하고 샘플을 포함하는 펌프를 분당 20 마이크로리터의 유량으로 설정합니다. 다음으로, 유동 시스템을 빠져나가는 나머지 튜브를 10%의 표백제 용기에 연결하여 유동 시스템을 종료한 후 세포를 폐기한다.
석영 모세관관의 단면을 현미경의 현장 시야에 트랜스듀서와 직접 정렬하여 튜브의 전체 폭을 비추도록 시료 위에 광섬유를 주의 깊게 배치할 수 있도록 한다. 1, 053 나노미터의 파장에서 작동하는 다이오드 펌핑 고체 레이저를 채널링하는 광섬유를 사용하여 샘플을 조사한다. 현미경 장착 카메라를 사용하여 흐름 시스템, 레이저 발사 및 흐름 시스템을 통한 샘플 의 통과를 기록합니다.
이 연구에서는, 광음향 유동 세포측정제 및 표적 구리 황화표적제는 난소 순환 종양 세포를 검출하는 데 사용된다. 합성된 나노입자의 전형적인 TEM 이미지는 일반적인 나노입자의 평균 크기가 약 8.6나노미터임을 보여준다. 각 입자의 수평 및 수직 직경은 서로 수직으로 측정되고 더 평균됩니다.
이러한 입자의 평균 유체 역학 직경은 73.6 나노미터입니다. 구리 황화물 나노 입자는 근적외선으로 확장 특징적인 흡광도 곡선을 갖는다. 분광계에 의해 레이저의 전환에 의해 발생하는 약 850 나노미터 주위에 약간의 유물이있다.
형광 태그 나노 입자로 배양 된 세포의 형광 현미경 이미지는 나노 입자 섭취량이 세포 전반에 걸쳐 형광의 존재에 의해 시각화 될 수 있음을 보여줍니다. 나노 입자로 배양되지 않은 세포는 형광 신호를 나타내지 않습니다. 이 형광 신호의 존재는 입자의 성공적인 섭취와 유동 시스템에서 검출되는 능력을 나타냅니다.
일반적인 데이터 수집 신호의 예는 여기에 표시됩니다. 원시 데이터는 나노입자 태그된 세포, PBS 및 엽산 캡핑 구리 황화물 나노입자 사이의 신호의 차이를 나타낸다. 사용자 지정 랩 뷰와 MATLAB 소프트웨어를 활용하여 이미지 재구성은 각각 실시간 및 사후 수집에서 긍정적이고 부정적인 컨트롤로 만들어집니다.
개별 봉투는 이후에 픽셀 값으로 변환되고 독립 열로 표시됩니다. 광음향 신호의 명확한 차이는 PBS와 엽산 캡핑 구리 황화 나노 입자 사이에 발생 하며 밀리리터당 100 마이크로그램의 농도가 있습니다. 이 절차 동안, 광음향 유동 세포측정 시스템 내에서 초음파 트랜스듀서, 현미경 및 광섬유를 적절히 정렬하는 것이 중요합니다.
양수 및 음수 컨트롤을 테스트하여 시스템 정렬을 확인합니다. 광음향 타겟팅 기술의 다양성과 PAFC를 사용하여 가능한 광범위한 응용 분야로 인해 이 기술은 번역적으로 중요한 임상 및 연구 응용 프로그램을 위한 길을 열어줍니다. 임상 적용을 보장하기 위해 추가 연구는 환자 샘플 테스트및 절차 단계의 감소에 중점을 두어야합니다.
나노 입자의 합성은 적절한 보호 장비를 활용하는 화학 연기 후드에서 수행해야합니다. 인간의 세포주 는 기관의 지침에 따라 처리해야합니다. 레이저를 사용하려면 방사선 안전 교육과 적절한 PPE가 필요합니다.
레이저 사용 및 광음향 테스트는 고도로 훈련된 인력에 의해서만 수행해야 합니다.
