Este trabajo fue apoyado en parte por números de concesión JSPS KAKENHI 24700349, 24659093, 25293239, JP18H02536 y 17 K 07086, números de concesión MEXT KAKENHI 25110737 y 23110525, AMED concesión número JP18ek0109311 y la Fundación de investigación médica de un y el Japón Fundación de investigación de la epilepsia.

Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el cuidado Animal y uso de la Tokyo Metropolitan Instituto de ciencias médicas. 8 postnatal - ratones de 16 semanas de edad se recomiendan. Cualquier cepa consanguínea es aceptable para el experimento. Ratones C57BL/6 son más resistentes a PTZ, que ratones albinos BALB/c y Suiza son más sensibles a PTZ. C57BL/6 fueron utilizados en este estudio. Vulnerabilidad a PTZ también depende de la edad del ratón. En comparación con ratones pequeños, ratones más viejos son más refractarios a PTZ35. El número de animales usados para este método puede variar, pero por lo menos 6 a 10 animales se requieren para cada condición.
1. preparación de PTZ
<ol><li>Disolver 2 mg/mL PTZ en estéril 0,9% (p/v) de NaCl. Preparar PTZ en el día de uso.</li>
</ol>2. inyección de PTZ
<ol><li>Realizar todos los experimentos entre 9:00 y 12:00 (mediodía).</li>
	<li>Medir el peso del cuerpo del animal.</li>
	<li>Coloque el animal en una cámara de observación para la habituación.</li>
	<li>Durante el período de habituación (3 min), calcular el volumen de solución PTZ para la inyección basada en el peso corporal del animal y la dosis de inyección previamente determinado. Nota: por ejemplo, cuando se utiliza 35 mg/kg PTZ, 0,875 mg de PTZ es necesario para un ratón pesa 25 g (35 mg / kg x 0,025 kg = 0.875 mg). Por lo tanto, se debe inyectar 437.5 μL de una solución de 2 mg/mL PTZ (0.875 mg/2 mg / mL = 0,4375 mL). La dosis de inyección de PTZ depende del genotipo del ratón y cepa. Para los ratones de tipo salvaje C57BL/6, se recomienda una dosis de 30-35 mg PTZ/kg de peso corporal para el primer ensayo. Sensibilidad a PTZ depende el ratón cepa utilizada36,37. La dosis de la inyección varía según el propósito del experimento.</li>
	<li>Inyectar por vía intraperitoneal PTZ con una jeringa de 1 mL conectada a una aguja de calibre 27 en el cuadrante derecho o izquierdo del abdomen del animal. Evitar inyectar en la línea media.<ol>
<li>Evitar inyecciones repetidas en la misma posición.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Observar el comportamiento de los animales durante 30 minutos después de la administración de PTZ (figura 1A) y clasificar y anotar el comportamiento anormal, tal como se muestra a continuación. Si es posible, mantener los animales bajo observación por 24 horas o menos después de la inyección adicional de 6-10 h, especialmente una vez que llega a la puntuación de gravedad de la crisis 3 o superior.<ol>
<li>Tenga en cuenta cualquier convulsiones suaves o cambios de comportamiento en los animales más allá del período de observación de 30 minutos. Esta prolongada observación período podrá dirigir un efecto particularmente importante y completo de una dosis subconvulsive de PTZ en la generación de crónica unprovoked asimientos en epilepsia.</li>
		<li>Además, medir la duración de la convulsión de cada asimiento observada como cambios en la duración de la convulsión se relacionan con la severidad de convulsiones. Por otra parte, la latencia a la primera crisis después de la inyección de PTZ es otra medida importante para recoger. Monitoreo de la frecuencia de convulsiones, duración y latencia es fundamental para cualquier estudio molecular después del asimiento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inyecte PTZ todos los días (figura 1A). El número de inyecciones depende del objetivo del experimento. Ejemplos representativos son los siguientes.<ol>
<li>Para generar animales totalmente encendidos, una vez que un animal experimenta una convulsión con una puntuación de 5 (convulsión tónico-clónica), final de la inyección dentro de tres administraciones más. En este caso, aumentar la dosis de inyección si el puntaje de convulsiones aumenta por tres administraciones consecutivas. Cada animal puede recibir un diferente número y dosis de las inyecciones de PTZ.</li>
		<li>Fijar el número y dosis de la inyección de PTZ en todas las condiciones para evaluar la vulnerabilidad a PTZ, incluyendo en las evaluaciones de fármacos antiepilépticos y estudios del fenotipo de ratones modificados genéticamente. Dar a todos los animales el mismo número de inyecciones de PTZ; se recomienda un total de 8 a 12 inyecciones. Si un animal muere, la puntuación de ataque debe ser denotada como 6.</li>
		<li>Determinar la dosis de inyección necesaria para mantener un asimiento alta puntuación (4 o 5) para que 10 o mas inyecciones para el estudio de los cambios histopatológicos que se producen las crisis epilépticas. En este caso, el número total de inyección debe estar comprendida entre 25 a 30. Disminuir la dosis de inyección si la puntuación de ataque llega a 5. Si la puntuación de ataque disminuye a 3 o más bajo, aumentar la dosis de la inyección.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. convulsión puntuación
<ol><li>Observar el comportamiento de los animales y registrar los resultados.<ol>
<li>Clasificar y anotar las conductas epilépticas como sigue38,39 (figura 1B): 0: el comportamiento normal, ninguna anormalidad. 1: inmovilización, acostado sobre el vientre. 2: cabeza mioclono asintiendo con la cabeza, facial, extremidad delantera o trasera. 3: mioclono continuo de todo el cuerpo, mioclónica sacudidas, cola se mantuvo rígidamente. 4: cría, tónico asimiento, cayendo a su lado. 5: convulsión tónico-clónica, cayendo de espaldas, salvaje corriendo y saltando. 6: la muerte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cambiar los criterios de comportamiento basados en el Racine puntuación40, dependiendo de las condiciones experimentales.</li>
</ol>4. Análisis de la incautación de
<ol><li>Análisis immunohistopathological<ol>
<li>Fijación de perfusión<ol>
<li>Preparación<ol>
<li>Disolver paraformaldehido (PFA) de 4% (p/v) en tampón de fosfato de 0,1 M (pH 7,4). Calentar la solución a aproximadamente 70 ° C con la adición de una gota de 1 M NaOH (aproximadamente 1 μl de 1 M NaOH para 50 mL de solución de PFA).</li>
				<li>Preparar helado 4% PFA y tampón fosfato salino (PBS).</li>
				<li>Configurar una bomba peristáltica, con tubo y aguja. Ejecutar aproximadamente 20 mL de agua a través del tubo para eliminar residuos. Luego, coloque el extremo abierto del tubo en PBS helado.</li>
			</ol>
</li>
			<li>Transcardial la perfusión y preparación del cerebro fijado<ol>
<li>Anestesiar profundamente el ratón con etanol a 50% isoflurane/50% en un pequeño recipiente.</li>
				<li>Mantenga el ratón en una posición supina fijando las puntas de sus extremidades anteriores y posteriores.</li>
				<li>Corta la línea media ventral del abdomen y exponer el diafragma.</li>
				<li>Cortar el diafragma a lo largo de la margen costal. Luego, corte ambos lados laterales de las costillas y el cuerpo. Pellizque el proceso xifoides por las pinzas de bloqueo y vuelque la caja torácica. Mantener la posición del proceso xifoides por fijación con una aguja o pellizcarla con fórceps. Exponer el corazón.</li>
				<li>Inserte la aguja en el ventrículo izquierdo y hacer un corte en el atrio derecho con unas tijeras. Tenga en cuenta no para empujar la aguja demasiado lejos en el corazón, como puede perforar una pared interior.</li>
				<li>Comenzar un flujo constante de PBS helado a través de la aguja para vaciar la sangre (aproximadamente 15-20 mL/min).</li>
				<li>Cuando la sangre ha desaparecido del cuerpo, hacia el tubo una solución de paraformaldehído al 4% (aproximadamente 60 mL) sin la adición de las burbujas. A continuación, detener la perfusión.</li>
				<li>Cortar el cuello trasero y la columna vertebral y pele la piel de la cabeza y la parte dorsal del cráneo con tijeras de disección.</li>
				<li>Cortar los huesos premaxilares entre las órbitas de los ojos y quitar totalmente la parte dorsal del cráneo.</li>
				<li>Crear un espacio entre el cerebro y el hueso yugal del lado posterior y cortar los nervios de trigeminal y el quiasma óptico por debajo del cerebro. Cuidadosamente Remueva el cerebro y colocarlo en un frasco que contiene 4% PFA. Después fije el cerebro a 4 ° C durante 12-16 h.</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
		<li>Preparación de corte de cerebro<ol>
<li>Transferir el cerebro fijado al 20% sacarosa/PBS hasta el cerebro se hunde en la solución para crioprotección.</li>
			<li>Cortar el cerebro fijado basado en el sector requiere orientación y necesaria parte del cerebro.</li>
			<li>Establecer la cryomicrotome. La hoja en posición y mantener la etapa de microtomo a temperaturas debajo de-20 ° C.</li>
			<li>Coloque el cerebro cortado en el escenario y el cerebro con 20% sacarosa/PBS de la capa. La solución de sacarosa/PBS congelará gradualmente, que cubre el cerebro en el escenario, hasta que el cerebro está completamente integrado en congelados 20% sacarosa/PBS.</li>
			<li>Cortar el cerebro (30 μm de espesor), deslizando la hoja a través del tejido. Transfiera las rebanadas de PBS y conservar a 4 ° C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Immunohistochemistry fluorescente<ol>
<li>Lave los cortes necesarios en 0,1% Triton X-100/PBS (SAFT) durante 10 minutos, 3 veces a temperatura ambiente (RT).</li>
			<li>Bloquear las rebanadas por los incubando previamente en SAFT con 2% cabra suero o 5% albúmina de suero bovino (BSA) para 1-2 h a TA.</li>
			<li>Incubar las rebanadas en una solución de anticuerpo con la concentración adecuada de anticuerpo primario previamente en SAFT con 2% cabra BSA suero o el 5% de 1 a 7 noches a 4 ° C.</li>
			<li>Lavar las rodajas en SAFT durante 10 min, 3 veces a TA.</li>
			<li>Incubar las rebanadas en una solución de anticuerpo secundario con la concentración adecuada de anticuerpos secundarios en SAFT para 1-2 h a temperatura ambiente, protegido de la luz.</li>
			<li>Montar los cortes sobre portaobjetos de vidrio y cubrir con medio de montaje y cubierta de vidrio.</li>
			<li>Observar las láminas con microscopía de fluorescencia.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Prueba de tres cámaras<ol>
<li>Preparación<ol>
<li>Preparar por lo menos 2 2 - ratones 129/Sv de 6 meses de edad del mismo sexo como los ratones de tema que el "ratón extraño." Habituarse a todos los ratones en la jaula antes del análisis. Para cada sesión de entrenamiento, coloque el ratón en la jaula y deje el ratón durante 15 minutos.</li>
			<li>Antes de cada fase de habituación con el mouse del objeto, limpiar todo el aparato y dos jaulas frotando la superficie con etanol al 70%.</li>
			<li>Colocar las jaulas vacías en los compartimientos laterales de los aparatos de cámara de 3 y abrir las puertas entre las cámaras.</li>
			<li>Habituar el ratón tema, colocar un ratón del tema en la cámara del centro y permitir el ratón moverse libremente en todo el aparato hasta que el ratón ha investigado dos jaulas, más animales tema 5 minutos adicionales que pueden estar temerosos de la jaula no investigar la jaula por 20 min y no debe ser utilizado para este análisis. Estos animales Evite la jaula y raramente se acercan a la jaula.</li>
			<li>Después de que el animal se mueve en la sala centro, cerrar las puertas y dejar que el ratón se mueven libremente en el compartimiento de centro durante 5 minutos. Durante este período, uno de los ratones 129/Sv pone en una jaula para habituarse a la jaula.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Análisis de la sociabilidad<ol>
<li>Llevar a cabo este análisis inmediatamente después del período de habituación del ratón tema.</li>
			<li>Colocar la jaula con un ratón 129/Sv, denominado la "jaula del extraño 1", en una de las cámaras del lado y la jaula vacía, denominada la "jaula del objeto", en la otra cámara de lado.</li>
			<li>Abra la puerta y monitorear el comportamiento del ratón tema.</li>
			<li>Permitir que el ratón tema moverse libremente durante 10 min y registrar los siguientes parámetros conductuales. Si el ratón tema tiene miedo del ratón en la jaula 1 extranjero, según lo indicado por el ratón evitando la extraño 1 jaula y queda en la esquina de una de las cámaras, el animal no puede usarse para el análisis. un) tiempo invertido en cada cámara, la cámara desconocido 1, cámara de objeto y compartimiento de centro. b) tiempo investigando cada jaula, la jaula 1 extranjero y la jaula del objeto. (El ratón se clasifica como investigar la jaula si el ratón es oler o toughing el ratón o jaula) c) el número de entradas en cada cámara (opcional) d) distancia total recorrida (opcional)</li>
			<li>Después de que el ratón se mueve en la sala del centro, cerca de las puertas.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Análisis de novedad social<ol>
<li>Llevar a cabo este análisis inmediatamente después del análisis de la sociabilidad.</li>
			<li>Limpie ambas jaulas con etanol al 70%.</li>
			<li>Coloque otro ratón 129/Sv en una de las jaulas, denominadas la "Extraño 2 jaula" y el lugar el extraño 2 jaula en una de las cámaras. Colocar el ratón extraño 1 en la jaula, denominada la "jaula del extranjero 1" y la jaula 1 desconocido en la otra cámara.</li>
			<li>Abra la puerta y monitorear el comportamiento del ratón tema.</li>
			<li>Permite el ratón tema para moverse libremente durante 10 min y medir los mismos parámetros conductuales descritos para el análisis de la sociabilidad. Nota: El ratón forastero 1 y 2 de extraño debe ser elegido al azar. La cámara desconocido 1 y objeto cámara así como el extraño 1 cámara y cámara extranjero 2 se deben determinar al azar.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Discriminación miedo contextual<ol>
<li>Acondicionamiento<ol>
<li>Antes de cada ensayo de condicionamiento, limpiando la superficie con etanol al 70% para limpiar el aparato experimental.</li>
			<li>Colocar un ratón en un aparato de acondicionado con condiciones específicas (aparato forma, color de la pared, material del piso, olor, iluminación y volumen de ruido de fondo deben ser predeterminados). Por ejemplo, el aparato de acondicionado utilizado aquí fue un aparato cuadrado con paredes de plexiglás transparente, un piso de rejilla metálica, un olor de etanol, brillo de 100 lux y 65 dB ruido blanco.</li>
			<li>El ratón de la condición de pie-choque con pseudo-random tiempo de descargas eléctricas 0.1 mA para 2 s x 3 veces a lo largo de 5 minutos.</li>
			<li>Volver el ratón a la jaula casera después de acondicionado.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Evaluación de la memoria<ol>
<li>Antes de cada evaluación, limpiando la superficie con etanol al 70% para limpiar el aparato experimental.</li>
			<li>Al día siguiente siguiente acondicionado, coloque el ratón en el mismo aparato como condición del choque y medir el tiempo de congelación a lo largo de 5 minutos.</li>
			<li>Más tarde el mismo día, coloque el ratón en un nuevo aparato y medir el tiempo de congelación durante una evaluación de 5 minutos. Aquí se utilizó un aparato triangular paredes de plexiglás blanco, piso de la placa, sin olor, brillo de 30 lux, y ruido de 70 dB blanco.</li>
			<li>Comparar el tiempo de congelación entre el mismo estado y condición de novela. Los ratones con una capacidad normal de memoria se congelarán más en las mismas condiciones que en la condición de novela. Congelación es definido inmovilidad del animal durante más de 2 s.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

Los autores no declaran conflictos de interés.

Aquí, presentamos un protocolo ampliamente accesible para el establecimiento de un modelo farmacológico de la epilepsia. Inflamación química mediada por PTZ tiene una larga historia y es un modelo comúnmente aceptado para el estudio de la patología celular y la histopatología de epilepsia41. El modelo de inflamación química de la epilepsia ha sido revisado previamente por Suzdak y Jansen, 199542. Inducción de convulsiones farmacológicas, especialmente con PTZ, es...

La epilepsia es un trastorno neurológico crónico que se caracteriza por convulsiones recurrentes y afecta aproximadamente al 1% de las personas. Los mecanismos subyacentes de generación epileptogénesis y convulsiones en pacientes con epilepsia no pueden ser totalmente clarificados en estudios clínicos. Por lo tanto, un modelo animal apropiado es necesario para el estudio de la epilepsia1.
Una gran variedad de modelos animales de epilepsia se han utilizado para investigar la fisiología de la epilepsia y para identificar los fármacos antiepilépticos2,3. Entre estos modelos, la inducción de convulsiones farmacológicas es un método común utilizado para generar un modelo animal para la investigación de la patología de la epilepsia4. Este método es barato y simple. Inflamación mediada por electrodo es también un método comúnmente utilizado, pero los costos de este procedimiento son más altos, y el método requiere habilidades quirúrgicas y eléctricos para inducir convulsiones repetitivas5.
Inducción farmacológica también es ventajosa porque el tiempo y el número de convulsiones se controlan fácilmente. Modelos de ratón genético que presentan convulsiones espontáneas también se utilizan en el estudio de la epilepsia. Sin embargo, la predicción de Cuándo y con qué frecuencia las convulsiones se presentan en estos modelos genéticos puede ser imposible6. Un sistema de seguimiento es necesario para observar el comportamiento epiléptico de ratones modificados genéticamente6.
Ácido kaínico, la pilocarpina y la pentylenetetrazole (PTZ) son ampliamente utilizados como inductores de incautación drogas7. El Ácido kaínico es un agonista de los receptores de glutamato, y pilocarpina activa los receptores colinérgicos. PTZ es un ácido gamma aminobutírico (GABA)-un antagonista del receptor del8. PTZ suprime la función de las sinapsis inhibitorias, una mayor actividad neuronal. Presente Reglamento causa asimientos generalizados en animales9. Una sola inyección de Ácido kaínico y pilocarpina puede inducir convulsiones agudas, especialmente status epiléptico (SE)10,11 y kaínico ácido o pilocarpina-mediada SE promueve crónica espontánea y recurrente asimientos12 , 13. las grabaciones electroencephalographic (EEG) y análisis de la conducta han indicado que las crisis recurrentes espontáneas se observan un mes después de una sola inyección12,13. Una sola inyección de una dosis convulsiva de PTZ también induce crisis aguda. Sin embargo, asimientos crónicos espontáneos después de una inyección única de PTZ son difíciles de promover. La administración crónica de PTZ es necesaria para inducir convulsiones repetitivas14. En cualquiera de los métodos, la generación de convulsiones repetitivas es capaz de inducir una patología más similar a la de la epilepsia humana que la generación de convulsiones agudas. En el caso de PTZ, cada inyección evoca una convulsión, y severidad de la crisis se convierte en más grave en una manera paso a paso con cada inyección. Por último, una sola inyección de PTZ de dosis bajas induce una severa convulsión tónico-clónica. En esta fase, cada inyección evoca las convulsiones severas. Además, la latencia de la convulsión y la duración también cambian en el transcurso de las inyecciones. La latencia a asimiento tónico se convierte a menudo más corta en esta última fase de inflamación15. Además, agravamiento de la convulsión se acompaña de una convulsión prolongada duración16. Investigar el mecanismo molecular que regula la gravedad de la crisis, latencia y duración es útil para la detección de drogas antiepilépticas17,18,19.
Comúnmente los asimientos son inducidos por una sola administración sistémica de PTZ y la recuperación es muy rápida, dentro de 30 min4,5. Así, el número de las convulsiones es más controlable en el modelo PTZ-astillas. Sin embargo, la supervisión de EEG ha indicado que pueden verse picos generalizadas hasta 12 h después de PTZ-medió incautación20. Por lo tanto, los animales preferiblemente deben permanecer bajo observación durante 24 h después de las convulsiones mioclónicas o tónico21 para análisis más preciso de los mecanismos de inflamación.
La administración de los fármacos antiepilépticos, como la etosuximida, valproato, fenobarbital, vigabatrina y retigabine3, antes o después de la inyección de PTZ mitiga el agravamiento de la convulsión severidad3,22, 23. Asimismo, ratones knockout que falta genes implicados en la exacerbación de convulsiones, como matriz metaloproteinasa-924,25 y neuritin FGF-2226, han demostrado exhibir convulsiones reducida gravedad después de inyecciones múltiples de PTZ. Además, observando alteraciones histopatológicas después de las crisis epilépticas es posible con este método. En pacientes con epilepsia del lóbulo temporal, hay cambios histológicos típicos en el cerebro, como la fibra musgosa brotación27,28, gránulo anormal neurona migración29, astrogliosis30, células neuronales muerte en el hipocampo31,32y esclerosis hipocampal33. Cambios similares se observan en animales epilépticos modelo. Entre los métodos disponibles, inflamación química mediada por PTZ es un método bueno, reproducible y barato para producir un modelo animal de epilepsia. En un modelo SE mediada por pilocarpina, control de las convulsiones es difícil y muchos ratones mueren o no a desarrollar SE34. En contraste, la mortalidad y la gravedad de la crisis son más controlables en el modelo PTZ. Además, PTZ es menos costoso que el Ácido kaínico y habilidades en cirugía de cerebro de ratón no son necesarios para la administración de la droga.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Pentylenetetrazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>MANAC</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse</td>
			<td>CLEA Japan</td>
			<td></td>
			<td>C57Bl/6NJcl, postnatal 8 week, male</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (1mL)</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS-01T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle(27G x 3/4&#34;) (0.40 x 19 mm)</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>NN-2719S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing scale</td>
			<td>Mettler</td>
			<td>PE2000</td>
			<td>This item is a discontinued product. Almost equivalent to FX-2000i with FXi-12-JA from A&#38;D company.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>31511-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristatic pump</td>
			<td>ATTO</td>
			<td>SJ1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>30404-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Yamato</td>
			<td>REM-700</td>
			<td>This item is a discontinued product. Almost equivalent to REM-710</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome blade</td>
			<td>Feather</td>
			<td>S35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-synaptoporin antibody</td>
			<td>Synaptic systems</td>
			<td>102 002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-ZnT3 antibody</td>
			<td>Synaptic systems</td>
			<td>197 002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-doublecortin</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-8066</td>
			<td>This item is a discontinued product. We did not test equivalent product (sc-271390).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Contextual fear discrimination test apparatus</td>
			<td>O&#39;hara</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Three chamber test apparatus</td>
			<td>Muromachi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pentylenetetrazole-induced kindling mouse model

Pentylenetetrazole (PTZ) es un antagonista del receptor GABA-A. La inyección intraperitoneal de PTZ en un animal induce una convulsión aguda, severa a una dosis alta, mientras que las inyecciones secuenciales de una dosis de subconvulsive se han utilizado para el desarrollo de la química, Yesca, un modelo de epilepsia. Una sola inyección de dosis bajas de PTZ induce una convulsión leve sin convulsión. Sin embargo, repetidas inyecciones de dosis bajas de PTZ disminuyen el umbral para evocar un ataque convulsivo. Por último, la administración continua de dosis bajas de PTZ induce una severa convulsión tónico-clónica. Este método es simple y ampliamente aplicable a investigar la patofisiología de la epilepsia, que se define como una enfermedad crónica que involucra convulsiones repetitivas. Este producto químico Yesca protocolo causa convulsiones repetitivas en animales. Con este método, se estimó la vulnerabilidad a ataques de PTZ-mediada o el grado de agravación de las crisis epilépticas. Estas ventajas han llevado a la utilización de este método para la detección de drogas antiepilépticas y genes relacionados con la epilepsia. Además, este método se ha utilizado para investigar daño neuronal después de ataques epilépticos debido a los cambios histológicos observados en los cerebros de pacientes epilépticos también aparecen en los cerebros de animales encendido química. Así, este protocolo es útil para la producción conveniente de modelos animales de epilepsia.

Inyección repetitiva de PTZ induce un aumento en la severidad de convulsiones. Seis ratones C57BL/6 fueron tratados con PTZ, y otro 6 ratones fueron tratados con solución salina como grupo de control. La dosis PTZ fue de 35 mg/kg, y 10 inyecciones fueron administradas. La puntuación de ataque aumentó gradualmente con inyecciones de PTZ, considerando que no hay ataques o comportamientos anormales fueron evocados por las inyecciones de solución Salinas (figura 2</s...

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Pentylenetetrazole-Induced Kindling Mouse Model

Este protocolo describe un método de química inflamación con pentylenetetrazole y proporciona un modelo de ratón de la epilepsia. Este protocolo también puede utilizarse para investigar la vulnerabilidad a la inducción de convulsiones y de la patogenesia después de las crisis epilépticas en los ratones.

Modelo murino de inflamación inducida por Pentylenetetrazole

Pentylenetetrazole (PTZ) is a GABA-A receptor antagonist. An intraperitoneal injection of PTZ into an animal induces an acute, severe seizure at a high ...

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Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

Múltiples imágenes del ratón neuroanatómicos de Resonancia Magnética

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Detection of Neuritic Plaques in Alzheimer's Disease Mouse Model

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder leading to dementia. Neuritic plaque formation is one of the pathological hallmarks of Alzheimer's disease. The central component of neuritic plaques is a small filamentous protein called amyloid &beta; protein (A&beta;)1, which is derived from sequential proteolytic cleavage of the beta-amyloid precursor protein (APP) by &beta;-secretase and &gamma;-secretase. The amyloid hypothesis entails that A&gamma;-containing plaques as the underlying toxic mechanism in AD pathology2. The postmortem analysis of the presence of neuritic plaque confirms the diagnosis of AD. To further our understanding of A&gamma; neurobiology in AD pathogenesis, various mouse strains expressing AD-related mutations in the human APP genes were generated. Depending on the severity of the disease, these mice will develop neuritic plaques at different ages. These mice serve as invaluable tools for studying the pathogenesis and drug development that could affect the APP processing pathway and neuritic plaque formation. In this protocol, we employ an immunohistochemical method for specific detection of neuritic plaques in AD model mice. We will specifically discuss the preparation from extracting the half brain, paraformaldehyde fixation, cryosectioning, and two methods to detect neurotic plaques in AD transgenic mice: immunohistochemical detection using the ABC and DAB method and fluorescent detection using thiofalvin S staining method.

One of the pathological characteristics of AD is the formation of Amyloid &#x03B2; protein positive neuritic plaques. In this protocol we describe two methods to detect neuritic plaques in transgenic AD model mice: immunohistochemical detection using the ABC and DAB method and fluorescent detection using thioflavin S staining method.

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Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder leading to dementia. Neuritic plaque formation is one of the pathological hallmarks ...

Methods for Intravenous Self Administration in a Mouse Model

Animal models have been developed to study the reinforcing effects of drugs, including the intravenous self-administration (IVSA) paradigm. The advantages of using an IVSA paradigm to study the reinforcing properties of drugs of abuse such as cocaine include the fact that the drug is self-administered instead of experimenter-administered, the schedule of reinforcement can be altered, and accurate measurement of the quantities of drug consumed as well as the timing and pattern of IV injections can be obtained. Furthermore, the intravenous route of administration avoids potential confounds related to first pass metabolism or taste, and produces rapid increases in blood and brain drug levels. As outlined in this video, intravenous self-administration can be obtained without prior food restriction or prior drug training following careful catheter placement during surgery and meticulous daily catheter flushing and maintenance. Experimental procedures outlined in this paper include a description of animal housing and acclimation methods, operant training using sweetened milk solutions, and catheter implantation surgery.

The intravenous self-administration (IVSA) paradigm is considered to be the gold standard in examining the reinforcing properties of drugs of abuse in rodents. This manuscript outlines the experimental procedures and surgical techniques necessary to obtain reliable IVSA data. In particular, meticulous catheter implantation and maintenance are highlighted.

Los métodos para Autoadministración intravenosa en un modelo de ratón

Animal models have been developed to study the reinforcing effects of drugs, including the intravenous self-administration (IVSA) paradigm. The advantages ...

Trypsin Digest Protocol to Analyze the Retinal Vasculature of a Mouse Model

Trypsin digest is the gold standard method to analyze the retinal vasculature 1-5. It allows visualization of the entire network of complex three-dimensional retinal blood vessels and capillaries by creating a two-dimensional flat-mount of the interconnected vascular channels after digestion of the non-vascular components of the retina. This allows one to study various pathologic vascular changes, such as microaneurysms, capillary degeneration, and abnormal endothelial to pericyte ratios. However, the method is technically challenging, especially in mice, which have become the most widely available animal model to study the retina because of the ease of genetic manipulations 6,7. In the mouse eye, it is particularly difficult to completely remove the non-vascular components while maintaining the overall architecture of the retinal blood vessels. To date, there is a dearth of literature that describes the trypsin digest technique in detail in the mouse. This manuscript provides a detailed step-by-step methodology of the trypsin digest in mouse retina, while also providing tips on troubleshooting difficult steps.

Trypsin digest is one of the most commonly used methods to analyze retinal vasculature. This manuscript describes the method in detail, including key alterations to optimize the technique and remove the non-vascular tissue while preserving the overall architecture of the vessels.

Tripsina Protocolo Resumen Para analizar la vasculatura de la retina de un modelo de ratón

Trypsin digest is the gold standard method to analyze the retinal vasculature 1-5. It allows visualization of the entire network of complex ...

The Corneal Micropocket Assay: A Model of Angiogenesis in the Mouse Eye

The mouse corneal micropocket assay is a robust and quantitative in vivo assay for evaluating angiogenesis. By using standardized slow-release pellets containing specific growth factors that trigger blood vessel growth throughout the naturally avascular cornea, angiogenesis can be measured and quantified. In this assay the angiogenic response is generated over the course of several days, depending on the type and dose of growth factor used. The induction of neovascularization is commonly triggered by either basic fibroblast growth factor (bFGF) or vascular endothelial growth factor (VEGF). By combining these growth factors with sucralfate and hydron (poly-HEMA (poly(2-hydroxyethyl methacrylate))) and casting the mixture into pellets, they can be surgically implanted in the mouse eye. These uniform pellets slowly-release the growth factors over five or six days (bFGF or VEGF respectively) enabling sufficient angiogenic response required for vessel area quantification using a slit lamp. This assay can be used for different applications, including the evaluation of angiogenic modulator drugs or treatments as well as comparison between different genetic backgrounds affecting angiogenesis. A skilled investigator after practicing this assay can implant a pellet in less than 5 min per eye.

The protocol describes the corneal micropocket assay as developed in mice.

El microbolsa Ensayo corneal: un modelo de angiogénesis en el ojo del ratón

The mouse corneal micropocket assay is a robust and quantitative in vivo assay for evaluating angiogenesis. By using standardized slow-release pellets ...

Measuring Progressive Neurological Disability in a Mouse Model of Multiple Sclerosis

After intracerebral infection with the Theiler's Murine Encephalomyelitis Virus (TMEV), susceptible SJL mice develop a chronic-progressive demyelinating disease, with clinical features similar to the progressive forms of multiple sclerosis (MS). The mice show progressive disability with loss of motor and sensory functions, which can be assessed with multiple apparatuses and protocols. Among them, the Rotarod performance test is a very common behavioral test, its advantage being that it provides objective measurements, but it is often used assuming that it is straightforward and simple. In contrast to visual scoring systems used in some models of MS, which are highly subjective, the Rotarod test generates an objective, measurable, continuous variable (i.e., length of time), allowing almost perfect inter-rater concordances. However, inter-laboratory reliability is only achieved if the various testing parameters are replicated. In this manuscript, recommendations of specific testing parameters, such as size, speed, and acceleration of the rod; amount of training given to the animals; and data processing, are presented for the Rotarod test.

An optimized testing protocol is presented in this paper for the Rotarod performance test, used for measuring progressive neurological disability in TMEV-infected mice.

La medición de la discapacidad neurológica progresiva en un modelo de ratón de la esclerosis múltiple

After intracerebral infection with the Theiler's Murine Encephalomyelitis Virus (TMEV), susceptible SJL mice develop a chronic-progressive demyelinating ...

Neurobehavioral Assessments in a Mouse Model of Neonatal Hypoxic-ischemic Brain Injury

We performed unilateral carotid artery occlusion on CD-1 mice to create a neonatal hypoxic-ischemic (HI) model and investigated the effects of neonatal HI brain injury by studying neurobehavioral functions in these mice compared to non-operated (i.e., normal) mice. During the study, Rice-Vannucci&#39;s method was used to induce neonatal HI brain damage in postnatal day 7-10 (P7-10) mice. The HI operation was performed on the pups by unilateral carotid artery ligation and exposure to hypoxia (8% O2 and 92% N2 for 90 min). One week after the operation, the damaged brains were evaluated with the naked eye through the semi-transparent skull and were categorized into subgroups based on the absence (&#34;no cortical injury&#34; group) or presence (&#34;cortical injury&#34; group) of cortical injury, such as a lesion in the right hemisphere. On week 6, the following neurobehavioral tests were performed to evaluate the cognitive and motor functions: passive avoidance task (PAT), ladder walking test, and grip strength test. These behavioral tests are helpful in determining the effects of neonatal HI brain injury and are used in other mouse models of neurodegenerative diseases. In this study, neonatal HI brain injury mice showed motor deficits that corresponded to right hemisphere damage. The behavioral test results are relevant to the deficits observed in human neonatal HI patients, such as cerebral palsy or neonatal stroke patients. In this study, a mouse model of neonatal HI brain injury was established and showed different degrees of motor deficits and cognitive impairment compared to non-operated mice. This work provides basic information on the HI mouse model. MRI images demonstrate the different phenotypes, separated according to the severity of brain damage by motor and cognitive tests.

We performed unilateral carotid artery occlusion on postnatal day 7-10 CD-1 mouse pups to create a neonatal hypoxic-ischemic (HI) model and investigated the effects of HI brain injury. We studied neurobehavioral functions in these mice compared to non-operated normal mice.

Evaluación neuroconductual en un modelo murino de lesión de cerebro hipóxico-isquémica Neonatal

We performed unilateral carotid artery occlusion on CD-1 mice to create a neonatal hypoxic-ischemic (HI) model and investigated the effects of neonatal HI ...

In Vivo Multimodal Imaging and Analysis of Mouse Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model

Laser-induced choroidal neovascularization (CNV) is a well-established model to mimic the wet form of age-related macular degeneration (AMD). In this protocol, we aim to guide the reader not simply through the technical considerations of generating laser-induced lesions to trigger neovascular processes, but rather focus on the powerful information that can be obtained from multimodal longitudinal in vivo imaging throughout the follow-up period.
The laser-induced mouse CNV model was generated by a diode laser administration. Multimodal in vivo imaging techniques were used to monitor CNV induction, progression and regression. First, spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) was performed immediately after the lasering to verify a break of Bruch&#39;s membrane. Subsequent in vivo imaging using fluorescein angiography (FA) confirmed successful damage of Bruch&#39;s membrane from serial images acquired at the choroidal level. Longitudinal follow-up of CNV proliferation and regression on days 5, 10, and 14 after the lasering was performed using both SD-OCT and FA. Simple and reliable grading of leaky CNV leasions from FA images is&#160;presented. Automated segmentation for measurement of total retinal thickness, combined with manual caliber application for measurement of retinal thickness at CNV sites, allow unbiased evaluation of the presence of edema. Finally, histological verification of CNV is performed using isolectin GS-IB4 staining on choroidal flatmounts. The staining is thresholded, and the isolectin-positive area is calculated with ImageJ.
This protocol is especially useful in therapeutics studies requiring high-throughput-like screening of CNV pathology as it allows fast, multimodal, and reliable classification of CNV pathology and retinal edema. In addition, high resolution SD-OCT enables the recording of other pathological hallmarks, such as the accumulation of subretinal or intraretinal fluid. However, this method does not provide a possibility to automate CNV volume analysis from SD-OCT images, which has to be performed manually.

In Vivo Multimodal Imaging and Analysis of Mouse Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model

Here, we present the usefulness of longitudinal in vivo imaging in the follow-up of morphological changes of laser-induced choroidal neovascularization in mice.

En Vivo La proyección de imagen multimodal y análisis del modelo de neovascularización coroidea inducida por láser Mouse

Laser-induced choroidal neovascularization (CNV) is a well-established model to mimic the wet form of age-related macular degeneration (AMD). In this ...

The Mouse Hindbrain As a Model for Studying Embryonic Neurogenesis

The mouse embryo forebrain is the most commonly employed system for studying mammalian neurogenesis during development. However, the highly folded forebrain neuroepithelium is not amenable to wholemount analysis to examine organ-wide neurogenesis patterns. Moreover, defining the mechanisms of forebrain neurogenesis is not necessarily predictive of neurogenesis in other parts of the brain; for example, due to the presence of forebrain-specific progenitor subtypes. The mouse hindbrain provides an alternative model for studying embryonic neurogenesis that is amenable to wholemount analysis, as well as tissue sections to observe the spatiotemporal distribution and behavior of neural progenitors. Moreover, it is easily dissected for other downstream applications, such as cell isolation or molecular biology analysis. As the mouse hindbrain can be readily analyzed in the vast number of cell lineage reporter and mutant mouse strains that have become available, it offers a powerful model for studying the cellular and molecular mechanisms of developmental neurogenesis in a mammalian organism. Here, we present a simple and quick method to use the mouse embryo hindbrain for analyzing mammalian neural progenitor cell (NPC) behavior in wholemount preparations and tissue sections.

This article demonstrates how the mouse embryonic hindbrain can be used as a model for studying developmental neurogenesis in both whole organ and tissue section preparations.

El cerebelo de ratón como modelo para el estudio de la neurogénesis embrionaria

The mouse embryo forebrain is the most commonly employed system for studying mammalian neurogenesis during development. However, the highly folded ...

Preparation and Implantation of Electrodes for Electrically Kindling VGAT-Cre Mice to Generate a Model for Temporal Lobe Epilepsy

It was discovered that electrical kindling of VGAT-Cre mice led to the spontaneous motor and electrographic seizures. A recent paper focused on how unique VGAT-Cre mice were used in developing spontaneous recurring seizures (SRS) after kindling and a likely mechanism - insertion of Cre into the VGAT gene - disrupted its expression and reduced GABAergic tone. The present study extends these observations to a larger cohort of mice, focusing on key issues such as how long the SRS continues after kindling and the effect of the animal's sex and age. This report describes the protocols for the following key steps: making headsets with hippocampal depth electrodes for electrical stimulation and for reading the electroencephalogram; surgery to affix the headset securely on the mouse's skull so that it does not fall off; and key details of the electrical kindling protocol such as duration of the pulse, frequency of train, duration of train, and amount of current injected. The kindling protocol is robust in that it reliably leads to epilepsy in most VGAT-Cre mice, providing a new model to test for novel antiepileptogenic drugs.

This report describes the methods to generate a model of temporal lobe epilepsy based on the electrical kindling of transgenic VGAT-Cre mice. Kindled VGAT-Cre mice may be useful in determining what causes epilepsy and for screening novel therapies.

Preparación e implantación de electrodos para encender eléctricamente ratones VGAT-Cre para generar un modelo para la epilepsia del lóbulo temporal

It was discovered that electrical kindling of VGAT-Cre mice led to the spontaneous motor and electrographic seizures. A recent paper focused on how unique ...