Cloruro de vinilo exacerba el daño hepático causado por otros factores como la dieta en concentraciones por debajo de las restricciones de seguridad actuales. Por lo tanto, los parámetros de uso para las poblaciones medias deben ser reevaluados. La principal ventaja de esta técnica es que utiliza un protocolo de inhalación crónico y no invasivo que imita de cerca la exposición humana, al tiempo que causa un estrés mínimo al animal.
Demostrando el procedimiento estarán Anna Lang, una post-doc, y Regina Schnegelberger, una estudiante de posgrado, ambas de mi laboratorio. Una semana antes del inicio de los experimentos de inhalación, pesar todos los animales experimentales y pesar la cantidad de alimentos de dieta baja o alta en grasas que se administrarán por jaula. Proporcione alimentos y agua ad libitum, reemplazando la comida regular para cada grupo de exposición por comida baja o alta en grasas, según corresponda.
Pesar el resto de los alimentos al final de cada día de alimentación y controlar a los ratones durante todo el experimento para asegurarse de que se mantiene la salud de los animales. Para configurar el sistema de exposición por inhalación de cloruro de vinilo, asegúrese de que el aire diluyente en las cámaras experimentales y de control sea aire de partículas de alta eficiencia y carbón activado filtrado, seco y regulado por presión antes de entrar en los dispositivos de medición de flujo respectivos. Confirme que la temperatura y la humedad relativa se monitorean desde dentro de las cámaras experimentales y de control, que el escape de la cámara se pasa a través de un filtro HEPA, una sonda de dióxido de carbono y un filtro de carbón activado, antes de entrar en el área de escape de la campana química para asegurarse de que los ratones están recibiendo ventilación aceptable.
El software personalizado se puede utilizar para cambiar, supervisar y registrar las variables ambientales de interés durante las exposiciones por inhalación. Para preparar la cámara para una exposición por inhalación, comience apagando todos los flujos de aire en las cámaras experimentales y de control. Abra cada puerta de la cámara y coloque el material absorbente de la ropa de cama, lado absorbente hacia arriba, en la parte superior de la sartén excreta.
A continuación, humedezca el material absorbente para proporcionar un nivel de humedad cómodo de aproximadamente 40 a 60% de humedad relativa durante todo el período de exposición y establezca el nivel de exposición deseado de cloruro de vinilo en la cámara experimental. Cuando las cámaras estén listas, transfiera los ratones a jaulas individuales dentro de los bastidores de la jaula de la cámara de inhalación, aleatorizando la colocación diaria de cada ratón dentro de los bastidores para asegurarse de que cada ratón se expone de forma homogénea dentro de las cámaras. A continuación, coloque cada estante de jaula en su cámara respectiva y cierre las puertas de la cámara.
Para llevar a cabo un experimento de exposición por inhalación, confirme que la válvula del tanque de gas cloruro de vinilo está en posición abierta y ajuste el flujo de diluyente para la cámara experimental a 25 litros por minuto. Confirme que el rotametro de la cámara de control está ajustado a 25 litros por minuto y compruebe que todos los sensores funcionan correctamente y que muestra los resultados esperados tanto en las cámaras experimentales como en las de control. A lo largo de la exposición, monitoree y registre el tiempo de exposición, el flujo diluyente, el flujo de cloruro de vinilo, la temperatura, la humedad, la presión de la cámara, el nivel de dióxido de carbono y la concentración teórica de cloruro de vinilo en la cámara experimental.
Confirme que la temperatura y la humedad de la cámara de control también se muestran, grafican y registran. Aproximadamente a la mitad de cada exposición, rompa las puntas de vidrio en un tubo detector de cloruro de vinilo y un tubo de pretratamiento y conecte el extremo de flujo del tubo detector de cloruro de vinilo a la bomba del tubo detector. Utilice una pieza corta de tubo para fijar el flujo al final del tubo detector de cloruro de vinilo al extremo de salida del tubo de pretratamiento y conecte una pieza corta de tubo al flujo al final del pretratamiento.
Retire un tapón de uno de los puertos de muestreo cerca de la zona de respiración y conecte el tubo del flujo al final del tubo de pretratamiento al puerto de muestreo. Desde la posición completa, extienda el mango del pistón de la bomba del tubo detector hasta la posición completa para tirar de 100 mililitros de gas muestreado de la cámara hacia el tubo detector de cloruro de vinilo. Después de 90 segundos, vuelva a empujar la manija.
Una vez obtenida la última muestra de gas, retire el tubo del puerto de muestreo de la cámara y vuelva a insertar el enchufe en el puerto. Inspeccione el cambio de color en el tubo detector de cloruro de vinilo para determinar la concentración de cloruro de vinilo dentro de la cámara y registre la lectura del tubo detector para la comparación con el valor teórico. Si se produce algún problema durante la exposición, ajuste el flujo de cloruro de vinilo a cero y aumente el flujo de diluyente a su valor máximo para purgar rápidamente la cámara.
Una vez alcanzada la duración de la exposición, el software apagará automáticamente el flujo de cloruro de vinilo. El temporizador de seguridad de 15 minutos comenzará a contar la duración de la cámara experimental para limpiar el cloruro de vinilo. Una vez que sea seguro eliminar los animales, haga clic en OK.
Al final del período de exposición, gire el tope de la válvula del tanque de gas de cloruro de vinilo a la posición cerrada y apague todos los flujos de aire en la cámara de exposición. Gire el rotametro hasta que no fluya aire a través de la cámara de control y retire la puerta de cada cámara. Retire los estantes de la jaula de las cámaras y transfiera a los ratones de vuelta a sus jaulas caseras bajo una capucha de flujo laminar.
A continuación, deseche cualquier residuo de la bandeja de excretas de acuerdo con las normas institucionales de salud y seguridad y limpie las puertas de la cámara, la sartén, los estantes de exposición y las cámaras. Aquí, se muestra el peso corporal semanal y el consumo de alimentos quincenales de un experimento de 12 semanas. Todos los ratones ganaron peso a lo largo de este estudio.
Sin embargo, mientras que los ratones en los grupos de dieta alta en grasas ganaron más peso en comparación con los ratones en los grupos de dieta baja en grasas, los ratones expuestos al cloruro de vinilo no ganaron más peso que los ratones en los respectivos grupos de control. El consumo de alimentos tampoco difería entre grupos. En estos representantes fotomicrografías de secciones hepáticas teñidas de H&E, cloruro de vinilo no causó cambios patólogos en el grupo de dieta baja en grasas.
La alimentación de dieta alta en grasas aumentó significativamente la esteatosis, se agravó aún más por la exposición al cloruro de vinilo. Por otra parte, la exposición al cloruro de vinilo en el grupo de dieta alta en grasas dio lugar a algunos focos inflamatorios. En los animales de dieta baja en grasas, cloruro de vinilo no aumentó los niveles de transaminasa, mientras que la dieta alta en grasas solo aumentó ligeramente la expresión de las transaminasas, con una mejora significativa de este efecto observado en el grupo de dieta alta en grasas expuesta al cloruro de vinilo.
Además, la dieta alta en grasas aumentó significativamente las relaciones de peso hígado a cuerpo, Aunque el cloruro de vinilo no impactó significativamente este efecto. Al implementar este protocolo, tenga siempre cuidado de que se tomen las precauciones de seguridad adecuadas para evitar la exposición involuntaria al cloruro de vinilo por parte de los seres humanos. Este procedimiento puede responder preguntas sobre efectos a corto, largo plazo y acumulativos del impacto de la exposición al cloruro de vinilo en la salud animal, el bienestar y el daño a los órganos.
Estos estudios afectan el campo de nuestra evaluación de riesgos ambientales y laborales. Por ejemplo, nuestro grupo estudia ahora las interacciones mecanicistas entre el cloruro de vinilo y la dieta.
