Este método de cultivo de Transwell se utiliza para estudiar la señalización paracrina utilizada por las células tumorales para suprimir la respuesta inmune. Este método se puede utilizar para descubrir ligandos secretos nuevos, así como los fundamentos mecánicos de sus efectos inmunosupresores. Anteriormente hemos utilizado este método para mostrar cómo los factores secretos por tumores pueden amortiguar la transcripción del gen proinflamatorio de los macrófagos.
Creemos que esta herramienta tiene amplias implicaciones en el estudio de la supresión inmune derivada del tumor. Una de las principales ventajas de esta técnica es que se puede utilizar para estudiar la señalización paracrina entre las células tumorales y las células inmunitarias sin la variable potencialmente confusa del contacto de célula a célula. Esta plataforma también es susceptible a una variedad de técnicas biológicas moleculares para el análisis posterior.
Después de cosechar macrófagos peritoneales, platéjeos directamente en las cámaras superiores de una placa de seis pozos de co-cultivo de membrana de poliéster de 0,4 micrómetros. Luego se añadió DMEM suplementado al pozo de tal manera que la cámara superior contiene un mililitro y la cámara inferior contiene 1,5 mililitros. Incubar durante tres días a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono.
En primer lugar, cultivo de células tumorales disponibles comercialmente en su medio respectivo, siguiendo los métodos de cultivo de tejido recomendados por ATCC. A continuación, lave las células tumorales adherentes una vez con PBS. Añadir 0.05%trypsin en EDTA e incubar a 37 grados Celsius hasta que las células se desprendan.
A continuación, vuelva a suspender las celdas en medios que contengan FBS. Utilice un hemocitoómetro o un contador de células para cuantificar el número total de células y centrífugas a 220 veces G durante cinco minutos para el pellet. Durante la centrifugación, aspirar el medio de las cámaras superior e inferior del macrófago que contiene placas de soporte de membrana permeables y reemplazarlo por medio fresco.
Para las cámaras inferiores donde se plancharán las células tumorales, llene con un mililitro de medio en lugar de 1,5 mililitros para dejar suficiente volumen para la adición celular. Cuando la centrifugación esté completa, aspirar el medio de las células tumorales peletificadas y volver a suspender las células en DMEM suplementado a una concentración de 300.000 células por mililitro. Añadir 0,5 mililitros de esta suspensión celular a la cámara inferior de los pozos deseados.
Para inducir la expresión génica proinflamatoria de macrófagos, trate los macrófagos solos o co-cultivados añadiendo interferón gamma a una concentración de 100 nanogramos por mililitro y LPS a una concentración de 50 nanogramos por mililitro. Variar la duración de los tiempos de tratamiento en el cultivo según sea necesario. La activación de macrófagos ocurre dentro de dos horas, y alguna supresión mediada por tumores ocurre por ocho horas.
El cultivo conjunto durante 24 horas produce una supresión robusta y consistente derivada de tumores. Como control negativo, los macrófagos de cultivo se sienten solos y no se tratan. Como control positivo, tratar los macrófagos cultivados por separado con interferón gamma y LPS en las mismas concentraciones utilizadas para las muestras.
Una vez transcurrido el tiempo de incubación deseado, aísle el lisato celular o el medio de cultivo de condición como desee, dependiendo de las necesidades de prueba. Para aislar el lisolato celular para el análisis cuantitativo de la reacción en cadena de la polimerasa, aspirar el medio de ambas cámaras del pozo y lavar una vez con dos mililitros de PBS. Aplique el búfer de lysis de ARN a la cámara superior que contiene los macrófagos.
Después de esto, raspe suavemente la membrana para liberar el izado celular y transferirla a un tubo de recolección para su posterior procesamiento de acuerdo con el protocolo del fabricante del kit de aislamiento de ARN. El método de co-cultivo descrito aquí implica el cultivo de macrófagos y células tumorales sin contacto físico. Los macrófagos peritoneales cultivados en ausencia de células tumorales se utilizan como controles negativos y positivos.
Los macrófagos peritoneales co-cultivados en presencia de células tumorales B16F10 pero sin activar estímulos no aumentan la expresión de genes asociados proinflamatorios. Esto implica que los ligandos secretos por tumores no son suficientes para inducir la expresión génica proinflamatoria por sí mismos, o si hay activación inmune por secreciones tumorales, los ligandos paracrinos son suficientes para suprimirlo a sus niveles nativos. Este método de cultivo co-cultivo ilustra que cuando los macrófagos polarizados por la gamma de interferón gamma y LPS se cultivan en presencia de células tumorales, la supresión de la expresión génica asociada a la inflamación se redujo hasta en un 60%A de un nivel comparable de supresión del gen proinflamatorio cuando la línea celular de macrófago murino J774 se sustituye por macrófagos peritoneales.
El trabajo anterior ha identificado la proteína S como un factor secreto por tumor que puede inhibir la activación de los macrófagos, por lo que el modelo de co-cultivo de soporte de membrana permeable se utiliza junto con una lysA para ensayar la concentración de proteína S en medios condicionados después de 24 horas. En medios condicionados a partir de células de melanoma B16F10 tratadas con interferón gamma y LPS, la proteína S se expresa en una concentración de aproximadamente 475 nanogramos por mililitro. Macrófagos peritoneales tratados en las mismas condiciones de proteína S expresada a aproximadamente 61 nanogramos por mililitro.
Curiosamente, cuando se co-cultiva, la concentración de proteína S en el interferón gamma y el pozo tratado con LPS fue de aproximadamente 86 nanogramos por mililitro. Esto sugiere que los macrófagos ingieren proteína S secretada por tumores o que la cantidad de proteína S secretada por las células B16F10 se reduce sustancialmente cuando en presencia de macrófagos. Estos resultados ponen de relieve cambios profundos en la activación de los macrófagos y la señalización paracrina cuando los macrófagos se cocultan con las células tumorales.
El método de co-cultivo transwell puede responder a una variedad de preguntas relacionadas con la señalización paracrina. El análisis de manchas occidentales podría llevarse a cabo para determinar cómo las proteínas secretadas por tumores alteran varias vías de señalización en los macrófagos.
