Con el uso de este protocolo los investigadores pueden identificar nuevos exomas o vesículas extracelulares y microcelulares basados en tejidos para el cáncer de próstata avanzado. Aislar el ARN de ambos tejidos F-F-B y vesículas extracelulares a menudo es difícil ya que la mayor parte de él es des creado o está en cantidad limitada Esta partícula profundizará en diferentes métodos para optimizar los insumos R-N-A y las bibliotecas C-D-N-A a los datos más específicos libres y de alta calidad para la secuenciación de próxima generación. La secuenciación de próxima generación ofrece la plataforma más completa para comprender la alteración de la molécula en el tumor que subyacen a la progresión tumoral esta partícula está optimizada con la muestra clínica de cáncer de próstata, y puede proporcionar nuevos conocimientos sobre la biología subyacente del cáncer de próstata agresivo avanzado.
La optimización de las bibliotecas C-D-N-A a partir de material de entrada baja es un paso crucial para una ejecución de secuenciación exitosa, por lo tanto, es muy importante generar bibliotecas C-D-N-A de alta calidad para obtener resultados precisos. Después de realizar la micro disección de los tejidos como se había hecho anteriormente, proceda a aislar las filas de descongelación derivadas de E-V de muestras de suero de pacientes a cuatro grados centígrados. Transfiera 110 micro litros de muestra de suero descongelada a un tubo y gire a dos mil veces G durante treinta minutos.
Elija el súper naden para el posterior aislamiento E-V o exosoma y deseche el pellet de desbree. A 30 microleters de reactivo de aislamiento exosoma sérico al súper natent. Una incubación de cuatro grados centígrados durante treinta minutos.
Gira a diez mil veces G durante diez minutos. Elija el súper nadent E-V cuidadosamente sin alterar el pellet en un tubo separado de 1,5 mililitros y almacene menos 80 grados Celsius para su análisis futuro. A continuación, vuelva a suspender el pellet E-V en 70 micro litros de P-B-S preparados en agua libre de nucleasas.
Después de aislar el R-N-A total de los tejidos micro diseccionados, y los E-V purificados utilizando kits comerciales, realicen la preparación de la biblioteca en cinco micro litros de un nanogrando normalizado por micro litro de muestra R-N-A a un micro litro de tres adaptadores primos. Precaliente el ciclor térmico a 70 grados centígrados e incuba la muestra durante dos minutos. Transfiera inmediatamente las muestras sobre hielo.
En un tubo separado mezclar dos micro litros de tampón de ligadura, un micro litro de inhibidor de la RNase y un micro litro de T4 ARN ligasa dos, un mutante de eliminación. Mezcle la ropa de cama de pastel de bye arriba y abajo. A continuación, agregue cuatro micro litros de la mezcla al tubo con el adaptador R-N-A 3 en hielo.
Precalentar el ciclor térmico a 28 grados Celsius. Y coloque el tubo en el ciclor térmico para incubar durante una hora. Después de eso, agregue un micro litro de solución de parada en el tubo mientras mantiene la muestra en el ciclo térmico.
Incubar a 28 grados centígrados durante otros 15 minutos. A continuación, retire inmediatamente el tubo y manténgalo en hielo. En un tubo separado añadir un microlitro de cinco adaptadores primos.
Transfiera a un ciclor térmico que se ha precalentado a 70 grados centígrados. Y incubar durante dos minutos. Coloque inmediatamente el tubo sobre hielo para evitar la reannealing de los adaptadores.
Agregue un micro litro de diez mililitros A-T-P al tubo de D natured cinco prime adapter. Mezclar adiós pastel y añadir un micro litro de T4 R-N-A ligase a la mezcla. Mezclar adiós pastel de orina.
Transfiera tres microlitros de esta mezcla al tubo que contiene los tres adaptadores principales ligados R-N-A. Coloque el tubo en el ciclor térmico que se ha precalentado a 28 grados centígrados e incubar durante una hora. Después de eso, transfiera inmediatamente el tubo al hielo y proceda más con las muestras o guárdelo a menos 80 grados Celsius para su uso futuro.
Para realizar R-T-P-C-R, utilice seis micro ligers de cada adaptador ligado R-N-A y agregue un micro liger de imprimación R-N-A R-T. Transfiera el tubo al ciclista térmico precalentado a 70 grados Centígrados e incubar durante dos minutos. Transfiera el tubo al hielo.
En un tubo separado mezclar dos micro litros de 5X, tampón de hebra, 5 micro litros de 12,5 milimoler DNTP, un micro litro de TDT milimolar, un micro litro de inhibidor de R-N-A y un micro litro de transcriptasa inversa. Agregue cinco microlitros de esta mezcla al ARN ligado adaptador y transfiérelo al ciclor térmico que se ha precalentado a 50 grados Celsius para incubar durante una hora. Después de una hora, transfiera el adaptador ligando el ADN de cortesía inmediatamente al hielo.
En un tubo separado, mezcle 25 microlitros de mezcla pcR, dos micro litros de imprimación RNA PCR, dos micro litros de índice de imprimación de ARN PCR y 8,5 microlitros de agua libre de ARN. Agregue 37,5 microlitros de esta mezcla a 12,5 microlitros del adaptador ligado CDNA. Transfiera el tubo al ciclor térmico que se ha precalentado a 98 grados centígrados.
Programe el ciclor térmico como se sugiere en el protocolo del fabricante con el número de ciclo modificado a 15. Después de la finalización, mantenga la muestra en cuatro grados centígrados. Proceda o almacene a menos 80 grados centígrados para su uso futuro.
Para purificar el ADN complementario ligado, agregue diez microlitros del tinte de carga de ADN a cada muestra de ADN de cortesía. Y a diez microlitros de la alta resolución de este último y ARN personalizado último. Ejecute 30 microlitros de cada muestra en dos carriles separados adyacentes entre sí en el gel de poliacrilamida de seis por ciento TBE.
Con ARN personalizado último y alta resolución, el espacio intermedio entre las dos muestras diferentes. Ejecute el gel en un tampón X TBE a 145 voltios durante aproximadamente 30 a 40 minutos. Lleve un registro de la parte inferior azul delantera del tinte de carga.
Detener la electroforesis cuando se acerca a la parte inferior del gel. Transfiera el gel en un tampón X TBE con 5 microgramos por milímetro de bromuro de etidio. Visualice el gel en un transiluminador y corte el gel con precisión entre el par base 145 y 160 marcadores de par base y ligeramente por encima del marcador de par base 145 para evitar la contaminación con dimer adaptador.
Un paso crítico es la purificación ligada CDNA que se realiza cortando el gel con precisión a medida que los dimers del adaptador funcionan muy perder a la marca deseada. Transfiera las piezas de gel a tubos de rotura de ADN guardados en tubos de recolección de dos milímetros. Gira a 20 mil veces G durante dos minutos.
Y añadir trescientos micro litros de agua libre de RNase y dejar que gire suavemente sobre un balancín durante la noche a temperatura ambiente. Para realizar la precipitación de ADN al día siguiente transfiera el contenido del tubo a tubos de filtro de 5 micras. Gira 600 veces G durante estrictamente diez segundos.
A continuación, agregue dos microlitros de glucógeno treinta microlitros de tres molares de acetato de sodio, 1X de pintura de pellets y 975 microlitros de etanol 100 por ciento al ADN eluido. Gira a 17.000 veces G a 4 grados centígrados durante 20 minutos. Deseche el sobrenadante y agregue 75 por ciento de etanol para lavar el pellet.
Después de girar a 17 mil veces G a cuatro grados centígrados durante cinco minutos desecar el sobrenadante e incubar los tubos a 37 grados centígrados en un bloque térmico evaporar completamente el etanol. Re suspenda el pellet con 12 microlitros de cloruro de tricider milimétrico a PH 8.5. A continuación, realice una comprobación de calidad de la biblioteca diluyendo el ADN purificado y complementario diez veces y utilizando un microlitro del CDNA diluido para funcionar con un bioanalizador.
Asegúrese de que el tamaño del producto de ADN complementario corresponde al rango del ARN pequeño en el electroferograma entre 136 y 160 pares base. Calcule la molaridad total para cada muestra. Normalizar cada muestra a 2 nanomolares utilizando el clorhidrato de tris a PH 8.5.
Sostenga las bibliotecas mezclando volúmenes iguales de cada dos muestras nanomolares en un solo tubo PCR de doscientos microlitros. Denatura y secuencia siguiendo los pasos descritos en el manuscrito. En este estudio se preparó la biblioteca después del aislamiento del ARN y se realizó un control de calidad.
El tamaño del producto para micro Rnase ligado al adaptador correspondía a aproximadamente 136 a 160 pares base para cada muestra. Las secciones resaltadas muestran la gama del gel que se excedió con precisión para la pequeña biblioteca de ARN de preparación. Esta figura muestra la electroforesis de gel y electroferogramas para la biblioteca de ADN de cortesía purificada.
Tejido FFPE micro diseccionado y EV derivados del suero. Las métricas representativas de una pequeña ejecución de secuenciación de ARN demuestran la densidad esperada del clúster, la puntuación Q, el porcentaje de filtro de paso de clúster y las tasas estimadas de rendimiento y error para el tejido FFP microsesinscriptado y los EV derivados del suero. La puntuación Q en ambas muestra un valor por encima de tres que indica el 99,9 por ciento de la precisión de la llamada base.
Y las tasas de error estaban todas por debajo de una. Cada paso en la preparación de la biblioteca debe ser cuidadosamente ejecutado y los tubos deben ser transferidos inmediatamente al hielo después de cada incubación. Un paso crítico en el protocolo es cortar el gel con precisión para asegurarse de que tiene un adaptador dimer libre y biblioteca CDNA puro.
La generación de la biblioteca CDNA requiere optimización para una ejecución de secuenciación de alta calidad. Comprender este protocolo ayudará a los espectadores a extrapolar estos detalles minúsculos a otra prepration de la biblioteca de secuenciación de muestras de fuentes limitadas que sugieren vesículas séricas y extracelulares. Esta técnica nos ha ayudado a identificar nuevas micronasas que están asociadas a la agresividad tumoral y la resistencia a la terapia en pacientes con cáncer de próstata metastásico.
Estas técnicas pueden extrapolarse a otros tipos de enfermedades que pueden ayudar en el descubrimiento de biomarcadores Novel. Como esta técnica utiliza materiales biológicos como muestras de suero y tejido derivados de la estrías, se deben tomar las precauciones adecuadas. Además, el bromuro de etidio es un carcinógeno conocido y debe manejarse con mucho cuidado mediante el uso de este protocolo.
