Com o uso deste protocolo, os pesquisadores podem identificar novos microcelulares à base de exome ou extracelulares e à base de tecidos para câncer de próstata avançado. Isolar o RNA de tecidos F-F-B e vesículas extracelulares é muitas vezes desafiador, pois a maioria é deserdada ou está em quantidade limitada Esta partícula irá elaborar diferentes métodos para otimizar as entradas R-N-A e bibliotecas C-D-N-A para gene mais específico dados livres e de alta qualidade para sequenciamento de próxima geração. O sequenciamento de geração seguinte oferece a plataforma mais abrangente para entender a alteração de moléculas no tumor que estão por trás da progressão do tumor esta partícula é otimizada com a amostra clínica do câncer de próstata, e pode fornecer novas percepções sobre a biologia subjacente do câncer de próstata agressivo avançado.
Otimizar as bibliotecas C-D-N-A a partir de material de baixa entrada é um passo crucial para uma execução de sequenciamento bem-sucedida, portanto, é muito importante gerar bibliotecas C-D-N-A de alta qualidade para obter resultados precisos. Depois de realizar micro dissecção de tecidos como feito anteriormente proceder a isolar as linhas de degelo derivadas do soro E-V de amostras de soro do paciente a quatro graus celsius. Transfira 110 micro litros de amostra de soro descongelado para um tubo e gire a duas mil vezes G por trinta minutos.
Eleja o super naden para o subsequente isolamento E-V ou exososome e descarte a pelota debree. Em 30 microletadores de reagente de isolamento exossomo sérico ao super natent. Um incuba-lo quatro graus celsius por trinta minutos.
Gire a dez mil vezes G por dez minutos. Eleja o E-V super nadent cuidadosamente sem perturbar a pelota em um tubo separado de 1,5 mililitro e armazene menos 80 graus Celsius para análise futura. Em seguida, suspenda a pelota E-V em 70 micro litros de P-B-S preparados em água livre de nuclease.
Depois de isolar o total de R-N-A de tecidos micro dissecados, e E-V purificados usando kits comerciais realizam a Preparação da Biblioteca em cinco micro litros de uma amostra de 40 nanogramas normalizada por micro litro R-N-A em um micro litro de três adaptadores prime. Pré-aqueça o cicloviário térmico a 70 graus celsius e incubar a amostra por dois minutos. Transfira imediatamente as amostras no gelo.
Em um tubo separado misture dois micro litros de tampão de ligadura, um micro litro de inibidor de RNase e um micro litro de T4 RNA ligase dois, um mutante de exclusão. Misture a cama de torta de tr valeria para cima e para baixo. Em seguida, adicione quatro micro litros da mistura ao tubo com o adaptador R-N-A 3 prime no gelo.
Pré-aqueça o cicloviário térmico a 28 graus Celsius. E coloque o tubo no cicloviário térmico para incubar por uma hora. Depois disso, adicione um micro litro de solução stop no tubo, mantendo a amostra no cicloviário térmico.
Incubar a 28 graus Celsius por mais 15 minutos. Em seguida, remova imediatamente o tubo e mantenha no gelo. Em um tubo separado adicione um microliter de cinco adaptador prime.
Transfira para um cicloviário térmico que foi pré-aquecido a 70 graus Celsius. E incubar por dois minutos. Coloque imediatamente o tubo no gelo para evitar o reativo dos adaptadores.
Adicione um micro litro de dez milimoleS A-T-P ao tubo de D naturalado cinco adaptador prime. Misture a torta de t bye e adicione um micro litro de liga ligase T4 R-N-A à mistura. Misture torta de trof.
Transfira três microliters desta mistura para o tubo contendo o adaptador de três prime ligado R-N-A. Coloque o tubo no cicloviário térmico que foi pré-aquecido a 28 graus celsius e incubar por uma hora. Depois disso, transfira imediatamente o tubo para o gelo e prossiga ainda mais com as amostras ou armazene a menos 80 graus Celsius para uso futuro.
Para executar R-T-P-C-R, use seis micro ligers de cada adaptador ligado R-N-A e adicione uma micro liger de R-N-A R-T primer a ele. Transfira o tubo para o cicloviário térmico pré-aquecido a 70 graus Celsius e incubar por dois minutos. Transfira o tubo para o gelo.
Em um tubo separado misture dois micro litros de 5X, tampão de fios, 5 micro litros de 12,5 milimoler DNTP's, um micro litro de 100 milimolar DTT, um micro litro do inibidor R-N-A, e um micro litro de transcriptase reversa. Adicione cinco microliters desta mistura ao adaptador ligado RNA e transfira-o para o cicloviário térmico que foi pré-aquecido a 50 graus Celsius para incubar por uma hora. Após uma hora de transferência, o adaptador ligava o DNA gratuito imediatamente ao gelo.
Em um tubo separado, misture 25 microliters de mix PCR, dois micro litros de primer RNA PCR, dois micro litros de índice de primer RNA PCR e 8,5 microliters de água livre do RNA. Adicione 37,5 microliters deste mix a 12,5 microliters do adaptador CDNA ligado. Transfira o tubo para o ciclo-de-tempo térmico pré-aquecido a 98 graus celsius.
Programe o ciclo cicruto térmico conforme sugerido no protocolo do fabricante com o número de ciclo modificado para 15. Após a conclusão, mantenha a amostra em 4 graus celsius. Proceda ou armazene a menos 80 graus celsius para uso futuro.
Para purificar o DNA de cortesia ligado, adicione dez microliters do corante de carregamento de DNA a cada amostra de DNA complementar. E para dez microliters da alta resolução última e RNA personalizada última. Execute 30 microliters de cada amostra em duas faixas separadas adjacentes umas às outras no gel de poliacrilamida TBE de 6%.
Com RNA personalizado último e de alta resolução, o espaço intermediário entre as duas amostras diferentes. Execute o gel em um buffer X TBE a 145 volts por aproximadamente 30 a 40 minutos. Mantenha o controle da frente azul inferior do corante de carregamento.
Pare a eletroforese quando se aproximar da parte inferior do gel. Transfira o gel em um buffer X TBE com 5 microgramas por brometo de etídio milimétrico. Visualize o gel em um transilluminador e corte o gel precisamente entre o par de base 145 e 160 marcadores de par de base e ligeiramente acima do marcador de par de base 145 para evitar contaminação com o adaptador dimer.
Um passo crítico é a purificação do CDNA ligado que é feito cortando o gel precisamente como os dimers adaptadores correm muito perdido para a marca desejada. Transfira as peças de gel para tubos de quebra de DNA mantidos em tubos de coleta de dois milímetros. Gire a 20 mil vezes G por dois minutos.
E adicione 300 micro litros de água sem RNase e deixe-o girar suavemente em um roqueiro durante a noite em temperatura ambiente. Para realizar a precipitação de DNA no dia seguinte, transfira o conteúdo do tubo para tubos de filtro de 5 mícrons. Gire 600 vezes G por estritamente dez segundos.
Em seguida, adicione dois microliters de glicogênio trinta microliters de três acetato de sódio molar, tinta de pelota 1X, e 975 microliters de 100% etanol para DNA elucido. Gire a 17.000 vezes G a 4 graus Celsius por 20 minutos. Descarte o supernasce e adicione 75% de etanol para lavar a pelota.
Depois de girar a 17 mil vezes G a quatro graus celsius por cinco minutos descarte o supernadante e incubar os tubos a 37 graus celsius em um bloco térmico evapora completamente o etanol. Suspender a pelota com 12 microlitadores de 10 milimães de cloreto tricider em PH 8.5. Em seguida, execute uma verificação de qualidade da biblioteca diluindo o DNA purificado e gratuito dez vezes e usando um microliter do CDNA diluído para executar em um bioanalífico.
Certifique-se de que o tamanho do produto de DNA gratuito corresponde à gama do pequeno RNA no eletroferograma entre 136 e 160 pares de base. Calcule a molaridade total de cada amostra. Normalize cada amostra para 2 nanomolar usando o cloridrato tris em PH 8.5.
Segure as bibliotecas misturando volumes iguais de cada amostra de nanomolar em um único tubo PCR de duzentos microliter. Desnaturação e sequência seguindo os passos descritos no manuscrito. Neste estudo, a biblioteca foi preparada após o isolamento do RNA e foi realizada uma verificação de qualidade.
O tamanho do produto para adaptação micro Rnase correspondeu a cerca de 136 a 160 pares de base para cada amostra. As seções destacadas mostram a amplitude do gel que foi precisamente extirpado para a pequena biblioteca de preparação RNA. Esta figura mostra a eletroforese gel e eletroferogramas para a biblioteca de DNA purificada e complementar.
Tecido FFPE micro dissecado e EV derivados de soro. As métricas representativas de uma pequena corrida de sequenciamento de RNA demonstram a densidade esperada do cluster, a pontuação Q, a porcentagem do filtro de passagem de cluster e as taxas estimadas de rendimento e erro para eV de tecido FFP micro dissecado e EV derivados do soro. O escore Q em ambas as amostras mostrou um valor acima de três indicando 99,9% da precisão da chamada base.
E as taxas de erro foram todas abaixo de uma. Cada passo na preparação da biblioteca deve ser cuidadosamente executado e os tubos devem ser imediatamente transferidos para o gelo após cada incubação. Um passo crítico no protocolo é cortar o gel precisamente para garantir que você tenha uma biblioteca CDNA livre e pura do adaptador.
A geração da biblioteca CDNA requer otimização para uma execução de sequenciamento de alta qualidade. Entender este protocolo ajudará os espectadores a extrapolar esses detalhes minuciosos para outras preparações de biblioteca de sequenciamento a partir de amostras de origem limitada sugerem vesículas sébios e extracelulares. Essa técnica nos ajudou na identificação de novas micronase associadas à agressividade tumorada e à resistência terapêutica em pacientes com câncer de próstata metastático.
Essas técnicas podem extrapolar para outros tipos de doenças que podem ajudar na descoberta de biomarcadores novos. Como essa técnica utiliza materiais biológicos, como soro derivado de estriação e amostras de tecido, deve-se tomar as precauções apropriadas. Além disso, o brometo de ethidium é um carcinógeno conhecido e deve ser cuidadosamente manuseado usando este protocolo.
