עם השימוש בפרוטוקול זה החוקרים יכולים לזהות exome הרומן או חוץ תאי מבוסס מיקרו הסלולר מבוסס רקמות עבור סרטן הערמונית מתקדם. בידוד RNA הן מרקמות F-F-B והן מזרעים חוץ-תאיים הוא לעתים קרובות מאתגר מכיוון שרובו נוצר או נמצא בכמות מוגבלת חלקיק זה ירחיב על שיטות שונות כדי לייעל את תשומות R-N-A וספריות C-D-N-A לגנים נתונים ספציפיים ביותר בחינם ובאיכות גבוהה עבור רצף הדור הבא. רצף הדור הבא מציע את הפלטפורמה המקיפה ביותר להבנת שינוי מולקולה בגידול העומד בבסיס התקדמות הגידול חלקיק זה מותאם עם מדגם קליני לסרטן הערמונית, והוא יכול לספק תובנות חדשניות על הביולוגיה הבסיסית של סרטן הערמונית אגרסיבי מתקדם.
אופטימיזציה של ספריות C-D-N-A מחומר קלט נמוך היא צעד מכריע להפעלת רצף מוצלחת ולכן חשוב מאוד ליצור ספריות C-D-N-A באיכות גבוהה כדי לקבל תוצאות מדויקות. לאחר ביצוע ניתוח מיקרו של רקמות כפי שנעשה בעבר להמשיך בידוד סרום נגזר E-V של Thaw שורות של דגימות סרום החולה בארבע מעלות צלזיוס. מעבירים 110 מיקרו ליטרים של דגימת סרום מופשרת לצינור ומסתובבים ב-2,000 פעמים G במשך שלושים דקות.
בחר את הנדן סופר עבור E-V הבאים או בידוד exosome ולהשליך את גלולת דברה. ב 30 microleters של סרום אקסוסום בידוד reagent לסופר natent. דגירה זה ארבע מעלות צלזיוס במשך שלושים דקות.
סובב בעשרת אלפים פעמים G במשך עשר דקות. בחר את E-V סופר nadent בזהירות מבלי להפריע גלולה בצינור נפרד 1.5 מיליליטר ולאחסן מינוס 80 מעלות צלזיוס לניתוח עתידי. ואז להשעות מחדש את גלולת E-V ב 70 מיקרו ליטרים של P-B-S מוכן במים ללא גרעין.
לאחר בידוד R-N-A הכולל מרקמות מיקרו ניתוח, ו E-V מטוהרים של באמצעות ערכות מסחריות לבצע הכנת הספרייה לתוך חמישה מיקרו ליטר של מדגם R-N-A מנורמל ארבעים גרם למיקרו ליטר במיקרו ליטר אחד של שלושה מתאם ראשוני. מחממים מראש את האופניים התרמיים ל-70 מעלות ומדגרים את הדגימה לשתי דקות. מיד להעביר את הדגימות על קרח.
בצינור נפרד לערבב שני ליטרים זעירים של חיץ קשירה, מיקרו ליטר אחד של מעכב RNase ומיקרו ליטר אחד של T4 RNA ligase שתיים, מוטציה מחיקה. מערבבים מצעי פאי ליפה למעלה ולמטה. לאחר מכן הוסיפו ארבעה מיקרו ליטרים של התערובת לצינור עם מתאם R-N-A 3 פריים על קרח.
מחממים את העגל התרמי ל-28 מעלות צלזיוס. ולמקום את הצינור במחזור התרמי כדי דגירה במשך שעה אחת. לאחר מכן, להוסיף מיקרו ליטר אחד של פתרון עצירה לתוך הצינור תוך שמירה על המדגם על האופניים התרמיים.
דגירה ב 28 מעלות צלזיוס לעוד 15 דקות. ואז מיד להסיר את הצינור ולשמור על קרח. בצינור נפרד להוסיף מיקרוליטר אחד של חמישה מתאם ראשוני.
העברה למחזור תרמי שחומם מראש ל-70 מעלות צלזיוס. ותתגרה במשך שתי דקות. מיד למקם את הצינור על הקרח כדי למנוע reannealing של המתאמים.
הוסף מיקרו ליטר אחד של עשרה מילימול A-T-P לצינור של D טבע חמישה מתאם עיקרי. מערבבים את ההיפוך של עוגת לירה ומוסיפים מיקרו ליטר אחד של קשירה T4 R-N-A לתערובת. מערבבים מצעי פאי לים.
העבר שלושה מיקרוליטרים של תערובת זו לצינור המכיל את שלושת המתאם העיקרי קשירה R-N-A. מניחים את הצינור על האופניים התרמיים כי כבר מחומם מראש ל 28 מעלות צלזיוס ודגירה במשך שעה אחת. לאחר מכן מיד להעביר את הצינור על הקרח או להמשיך עוד יותר עם הדגימות או לאחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי.
כדי לבצע R-T-P-C-R, השתמש בשישה ליג'רים זעירים של כל מתאם המגררים R-N-A והוסף לו מיקרו-ליגר אחד של R-N-A R-T. מעבירים את הצינור למחזור התרמי שחומם מראש ל-70 מעלות ומטמיעה במשך שתי דקות. העבר את הצינור לקרח.
בצינור נפרד לערבב שני מיקרו ליטר של 5X, חיץ גדיל, 5 מיקרו ליטר של 12.5 milimoler DNTP של, מיקרו ליטר אחד של 100 milimolar DTT, מיקרו ליטר אחד של מעכבי R-N-A, ומיקרו ליטר אחד של תעתיק הפוך. הוסף חמישה microliters של תערובת זו RNA קשירה מתאם ולהעביר אותו למחזור התרמי כי כבר שחומם מראש ל 50 מעלות צלזיוס כדי דגירה במשך שעה אחת. לאחר שעה להעביר את המתאם קשירה DNA חינם מיד לקרח.
בצינור נפרד, מערבבים 25 מיקרוליטרים של תערובת PCR, שני מיקרו ליטרים של פריימר PCR RNA, שני מיקרו ליטרים של אינדקס פריימר PCR RNA, ו 8.5 microliters של מים חינם של RNA. הוסף 37.5 מיקרוליטרים של תערובת זו ל-12.5 מיקרוליטר של CDNA עם חיבור מתאם. מעבירים את הצינור למחזור התרמי שחומם מראש ל-98 מעלות צלזיוס.
תכנת את רכיב האופניים התרמי כפי שהוצע בפרוטוקול היצרן כאשר מספר המחזור שונה ל- 15. לאחר השלמת, לשמור על המדגם בארבע מעלות צלזיוס. המשך או אחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי.
כדי לטהר את הדנ"א המשלים, הוסיפו עשרה מיקרוליטרים של צבע טעינת הדנ"א לכל דגימת דנ"א משלימה. ול-10 מיקרוליטרים של הרזולוציה הגבוהה האחרונה וה-RNA המותאם אישית. הפעל 30 מיקרוליטרים של כל מדגם בשני נתיבים נפרדים הסמוכים זה לזה בג'ל פוליאקרילמיד TBE שישה אחוזים.
עם RNA מותאם אישית האחרון ברזולוציה גבוהה האחרון, רווח הביניים בין שתי דגימות שונות. הפעל את הג'ל במאגר X TBE אחד ב 145 וולט במשך כ 30 עד 40 דקות. עקוב אחר החזית הכחולה התחתונה של צבע הטעינה.
עצרו את האלקטרופורזה כשהיא מתקרבת לתחתית הג'ל. מעבירים את הג'ל במאגר X TBE אחד עם 5 מיקרוגרם לאתידיום ברומיד מילימטר. דמיינו את הג'ל בטרנסילומינטור וחתכו את הג'ל בדיוק בין 145 סמני הבסיס ל-160 סמני זוג הבסיס ומעט מעל סמן 145 זוג הבסיסים כדי למנוע זיהום עם עמעום מתאם.
צעד קריטי הוא טיהור CDNA מגררת שנעשה על ידי חיתוך הג'ל בדיוק כמו עמעום מתאם לרוץ מאוד לאבד את המותג הרצוי. מעבירים את חתיכות הג'ל לצינורות שבירת דנ"א שנשמרו בשני צינורות איסוף מילימטר. תסתובב ב-20 אלף פעמים למשך שתי דקות.
ולהוסיף 300 מיקרו ליטרים של מים נטולי RNase ולאפשר לו להסתובב בעדינות על נדנדה לילה בטמפרטורת החדר. כדי לבצע את משקעים DNA ביום שלמחר להעביר את התוכן של הצינור ל 5 צינורות מסנן מיקרון. ספין 600 פעמים G במשך עשר שניות בלבד.
לאחר מכן הוסיפו שני מיקרוליטרים של גליקוגן שלושים מיקרוליטרים של שלושה נתרן אצטט טוחן, צבע גלולה 1X ו-975 מיקרוליטרים של 100 אחוז אתנול לדנ"א אלוט. סובב ב 17, 000 פעמים G ב 4 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. להשליך את supernatant ולהוסיף 75 אחוז אתנול לשטוף את גלולה.
לאחר ספינינג ב 17,000 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות להשליך את העל-טבעי דגירה הצינורות ב 37 מעלות צלזיוס על בלוק תרמי לחלוטין להתאדות את האתנול. להשעות מחדש את גלולה עם 12 microliters של 10 מילימולר טריידר כלוריד ב PH 8.5. לאחר מכן לבצע בדיקת איכות הספרייה על ידי דילול DNA מטוהרים חינם עשר פעמים באמצעות microliter אחד של CDNA מדולל לרוץ על bioanalyzer.
ודא שגודל מוצר הדנ"א המשלים תואם לטווח ה-RNA הקטן באלקטרופרוגרמה בין 136 ל-160 זוגות בסיסים. חשב את הטוטנות הכוללת עבור כל דגימה. לנרמל כל מדגם ל 2 nanomolar באמצעות טריס הידרוכלוריד ב PH 8.5.
החזק את הספריות על-ידי ערבוב כמויות שוות של כל דגימת ננו-מולאר בצינור PCR יחיד של מאתיים מיקרוליטר. התנערות ורצף בעקבות השלבים כמתואר בכתב היד. במחקר זה הוכנה הספרייה לאחר בידוד RNA ובוצעו בדיקות איכות.
גודל המוצר עבור מיקרו Rnase קשור מתאם התאים כ 136 כדי 160 זוגות בסיס עבור כל מדגם. הקטעים המודגשים מראים את מגוון הג'ל שנצץ במדויק לספריית הכנה קטנה של RNA. איור זה מראה את אלקטרופורזת הג'ל ואת האלקטרופרוגרמות לספריית הדנ"א המטוהרת.
מיקרו לנתח רקמת FFPE וסרום נגזר EV של. המדדים הייצוגיים מהפעלה קטנה של רצף RNA מדגימים את צפיפות האשכולות הצפויה, ציון Q, אחוז מסנן עובר באשכול ואת שיעורי התשואה והשגיאות המשוערים עבור רקמת FFP וסרום שנגזרו ממיקרו. ציון ה- Q בשתי הדגימות הראה ערך מעל שלוש המציין 99.9 אחוזים של דיוק שיחת הבסיס.
ותעריפי השגיאה היו כולם מתחת לאחד. כל שלב בהכנת הספרייה צריך להתבצע בקפידה צינורות יש להעביר מיד לקרח לאחר כל דגירה. שלב קריטי בפרוטוקול הוא חיתוך הג'ל בדיוק כדי להבטיח שיש לך ספריית CDNA נטולת עמעום מתאם.
יצירת ספריית CDNA דורשת מיטוב להפעלת רצף באיכות גבוהה. הבנת פרוטוקול זה תסייע לצופים לשער פרטים קטנים אלה להכנה אחרת של ספריית רצף מדגימות מקור מוגבלות להציע סרום ו vesicles חוץ תאיים. טכניקה זו סייעה לנו בזיהוי מיקרונאז חדש הקשורים תוקפנות הגידול והתנגדות טיפול בחולים בסרטן הערמונית גרורתי.
טכניקות אלה יכולות לשער לסוגי מחלות אחרים שיכולים לסייע בגילוי סמן ביולוגי חדשני. כמו טכניקה זו משתמשת בחומרים ביולוגיים כגון סטריציה נגזר סרום ודגימות רקמה, יש לנקוט אמצעי זהירות מתאימים. כמו כן, אתידיום ברומיד הוא מסרטן ידוע ויש לטפל בו בזהירות רבה באמצעות פרוטוקול זה.
