이 프로토콜의 사용으로 연구원은 고급 전립선 암을 위한 새로운 exome 또는 세포외 소포 기지를 둔 및 조직 기지를 둔 마이크로 세포를 확인할 수 있습니다. F-F-B 조직과 세포외 소포 모두에서 RNA를 분리하는 것은 대부분의 조직이 만들어지거나 제한된 수량이기 때문에 이 입자는 차세대 시퀀싱을 위한 가장 구체적인 자유롭고 고품질의 데이터를 유전자에 R-N-A 입력 및 C-D-N-A 라이브러리를 최적화하는 다양한 방법에 대해 정교하게 설명할 것입니다. 차세대 시퀀싱은 종양 진행의 근간이 전립선암 임상 샘플에 최적화되어 종양 진행의 근간을 이해하는 가장 포괄적인 플랫폼을 제공하며, 첨단 공격적인 전립선암의 근본적인 생물학에 대한 새로운 통찰력을 제공할 수 있다.
낮은 입력 재질에서 C-D-N-A 라이브러리를 최적화하는 것은 성공적인 시퀀싱 실행을 위한 중요한 단계이므로 정확한 결과를 얻기 위해 고품질 C-D-N-A 라이브러리를 생성하는 것이 매우 중요합니다. 이전에 수행 된 조직의 마이크로 해부를 수행 한 후 4 섭씨에서 환자 혈청 샘플의 E-V의 해동 행을 분리하는 진행. 해동세럼 샘플 110마이크로리터를 튜브로 옮기고 30분 동안 2천 회 G로 회전합니다.
후속 E-V 또는 엑소솜 절연슈퍼 나덴을 선택하여 데브리 펠릿을 폐기한다. 30 마이크로레터에서 혈청 엑소솜 절연 시약에서 슈퍼 나텐트에. 30 분 동안 섭씨 4도를 인큐베이션합니다.
10분 동안 1만 회 G에서 회전합니다. 별도의 1.5 밀리리터 튜브에 펠릿을 방해하지 않고 E-V 슈퍼 네이덴트를 신중하게 선출하고 향후 분석을 위해 영하 80도를 저장하십시오. 그런 다음 뉴클레아제 프리 워터에서 제조된 70마이크로 리터의 P-B-S에서 E-V 펠릿을 다시 중단한다.
마이크로 해부 된 조직에서 총 R-N-A를 분리한 후, 상용 키트를 사용하여 정제 된 E-V는 3 개의 프라임 어댑터 의 한 마이크로 리터에서 마이크로 리터 R-N-A 샘플당 정규화된 40 나노그램의 5 마이크로 리터로 라이브러리 준비를 수행합니다. 열 순환기를 섭씨 70도로 예열하고 샘플을 2분간 배양합니다. 즉시 얼음에 샘플을 전송합니다.
별도의 튜브에서 결찰 버퍼의 두 마이크로 리터, RNase 억제제 1 마이크로 리터 및 T4 RNA 리개세 2, 삭제 돌연변이의 1 마이크로 리터를 혼합합니다. 바이 파이 침구를 위아래로 섞는다. 그런 다음 얼음에 R-N-A 3 프라임 어댑터와 함께 튜브에 믹스의 4 마이크로 리터를 추가합니다.
열 순환기를 섭씨 28도로 예열합니다. 그리고 튜브를 열 사이클러에 1 시간 동안 배양합니다. 그 후, 열 사이클러에 샘플을 유지하면서 튜브에 정지 용액 의 마이크로 리터 를 추가합니다.
섭씨 28도에서 15분 간 배양하세요. 그런 다음 즉시 튜브를 제거하고 얼음을 유지합니다. 별도의 튜브에서 5개의 프라임 어댑터의 마이크로리터 1개를 추가합니다.
섭씨 70도로 예열된 열 사이클러로 옮김합니다. 그리고 2 분 동안 배양. 즉시 어댑터의 재annealing을 방지하기 위해 얼음에 튜브를 배치합니다.
D 특성 5 프라임 어댑터의 튜브에 10 밀리몰 A-T-P의 마이크로 리터 를 추가합니다. 바이 파이 페딩을 혼합하고 믹스에 T4 R-N-A 리갈아의 마이크로 리터 1 개를 추가합니다. 안녕 파이 페딩을 섞는다.
이 믹스의 3개의 마이크로리터를 3개의 프라임 어댑터 계각 R-N-A를 포함하는 튜브로 옮기. 예열된 열 사이클러에 튜브를 섭씨 28도로 예열하고 1시간 동안 배양합니다. 그 후 즉시 튜브를 얼음으로 옮기고 샘플을 더 진행하거나 향후 사용을 위해 영하 80도에서 저장합니다.
R-T-P-C-R을 수행하려면 각 어댑터 리게트 R-N-A의 6개의 마이크로 리거를 사용하고 R-N-A R-T 프라이머의 마이크로 리거 1개를 추가합니다. 튜브를 예열된 열 사이클러로 옮기고 섭씨 70도로 옮기고 2분 동안 배양합니다. 튜브를 얼음으로 옮기습니다.
별도의 튜브믹스5X, 가닥 버퍼, 5 마이크로 리터 12.5 밀리몰러 DNTP, 100 밀리몰러 DTT의 1 마이크로 리터, R-N-A의 억제제 1마이크로 리터, 그리고 역전사 1 마이크로 리터. 어댑터 리게팅 된 RNA에이 믹스의 5 마이크로 리터를 추가하고 1 시간 동안 배양하기 위해 섭씨 50도로 예열 된 열 사이클러로 전송합니다. 1시간 후 어댑터가 무료 DNA를 얼음으로 즉시 래그드했습니다.
별도의 튜브에서 PCR 믹스 25 마이크로리터, RNA PCR 프라이머 2개, RNA PCR 프라이머 지수 2개, RNA 자유 수분 8.5마이크로리터를 혼합합니다. 어댑터 리게싱 CDNA의 12.5 마이크로리터에 이 믹스의 37.5 마이크로리터를 추가합니다. 튜브를 예열된 열 사이클러로 98°C로 옮기습니다.
제조업체의 프로토콜에서 제안된 대로 열 순환기를 15로 수정한 사이클 번호를 프로그래밍합니다. 완료 후 샘플을 섭씨 4도로 유지하십시오. 진행 하거나 향후 사용을 위해 영하 80도에서 저장.
ligated 무료 DNA를 정화하려면 각 무료 DNA 샘플에 DNA 로딩 염료 10 마이크로리터를 추가합니다. 및 고해상도 후자 및 사용자 정의 RNA 후자의 10 마이크로 리터에. 6% TBE 폴리아크릴아미드 젤에서 서로 인접한 두 개의 별도 차선에서 각 샘플의 30 마이크로리터를 실행합니다.
사용자 지정 RNA 후자 및 고해상도 후자를 사용하면 두 개의 서로 다른 샘플 사이의 중간 공간이 있습니다. 젤을 145볼트에서 약 30~40분간 1X TBE 버퍼로 실행합니다. 로딩 염료의 아래 파란색 전면을 추적합니다.
젤 바닥에 접근할 때 전기전도를 중지합니다. 밀리미터 에디듐 브로마이드당 5 마이크로그램으로 하나의 X TBE 버퍼로 젤을 전달합니다. 겔을 트랜실루미네이터로 시각화하고 145개의 베이스 쌍과 160개의 베이스 쌍 마커 사이를 정밀하게 겔을 잘라내고 145개의 베이스 쌍 마커 보다 약간 높은 어댑터 이질로 오염을 방지합니다.
중요한 단계는 어댑터 디머가 원하는 브랜드에 매우 손실실행으로 정확하게 젤을 절단하여 수행되는 정제 계각 CDNA입니다. 젤 조각을 2밀리미터 수집 튜브에 보관된 DNA 브레이킹 튜브로 전달합니다. 2분 동안 20,000회 G로 회전합니다.
그리고 300 마이크로 리터의 RNase 없는 물을 추가하고 실온에서 하룻밤 동안 로커에서 부드럽게 회전 할 수 있습니다. 다음 날에 DNA 강수량을 수행하기 위해 튜브의 내용을 5 미크론 필터 튜브로 전송한다. 엄격하게 10 초 동안 600 배 G를 회전합니다.
그런 다음 3개의 어금음 나트륨 아세테이트의 글리코겐 30 마이크로리터의 2개의 마이크로리터, 1X 펠릿 페인트 및 100% 에탄올의 975마이크로리터를 경례된 DNA에 추가합니다. 섭씨 4도에서 17, 000배 G에서 20분간 회전합니다. 상체를 버리고 75 %의 에탄올을 추가하여 펠릿을 씻습니다.
섭씨 4도에서 17,000회 G에서 5분간 회전한 후 상류제를 버리고 열 블록에서 37°C의 튜브를 배양하여 에탄올을 완전히 증발시다. 다시 펠릿을 12 마이크로리터의 10 밀리머 트리피더 염화물PH 8.5에서 중단합니다. 다음으로 정제되고 무료 DNA를 10회 희석하고 희석된 CDNA의 마이크로리터 1개를 사용하여 생체 분석기에서 실행하여 라이브러리 품질 검사를 수행합니다.
무료 DNA 제품 크기가 136과 160 개의 염기 쌍 사이의 전기 페로그램의 작은 RNA 범위에 해당하는지 확인하십시오. 각 샘플에 대한 총 어금니를 계산합니다. 각 샘플을 PH 8.5에서 염산염삼액을 사용하여 2나노몰러로 정규화한다.
단일 200 마이크로 리터 PCR 튜브에 각 두 나노 몰라 샘플의 동일한 볼륨을 혼합하여 라이브러리를 유지합니다. 원고에 설명된 대로 단계를 따르는 변성 및 시퀀스. 이 연구에서 라이브러리는 RNA 격리 후 제조되었고 품질 검사가 수행되었다.
어댑터 리게트 마이크로 Rnase의 제품 크기는 각 샘플에 대해 약 136 에서 160 염기 쌍에 대응하였다. 강조 된 섹션은 정확하게 준비의 작은 RNA 라이브러리에 대한 절제 된 젤의 범위를 보여줍니다. 이 수치는 정제 된 무료 DNA 라이브러리용 젤 전기 전구 및 전기 페로그램을 보여줍니다.
마이크로 해부 FFPE 조직 및 혈청 파생 EV의. 작은 RNA 시퀀싱 실행의 대표적인 메트릭은 예상 클러스터 밀도, Q 점수, 클러스터 통과 필터 백분율 및 마이크로 해부된 FFP 조직 및 혈청 파생 EV에 대한 예상 수율 및 오차 비율을 보여줍니다. 두 샘플의 Q 점수는 기본 호출 정확도의 99.9%를 나타내는 3개 이상의 값을 보여 주였습니다.
그리고 오류 율은 모두 하나 이하였다. 도서관 준비의 각 단계는 신중하게 실행되어야하며 각 배양 후 튜브를 즉시 얼음으로 옮겨야합니다. 프로토콜의 중요한 단계는 어댑터가 없고 순수한 CDNA 라이브러리를 보장하기 위해 젤을 정확하게 절단하는 것입니다.
CDNA 라이브러리를 생성하려면 고품질 시퀀싱 실행에 최적화가 필요합니다. 이 프로토콜을 이해하면 제한된 소스 샘플에서 다른 시퀀싱 라이브러리 준비에 이러한 미세 세부 정보를 추정하는 시청자가 혈청 및 세포 외 소포를 제안합니다. 이 기술은 전이성 전립선암 환자에서 종양 공격성 및 치료 저항과 연관되는 새로운 micronase를 확인하는 데 도움이되었습니다.
이 기술은 새로운 biomarker 발견에 원조할 수 있는 그밖 질병 모형으로 추정할 수 있습니다. 이 기술은 striation 파생 혈청 및 조직 샘플과 같은 생물학적 물질을 사용하기 때문에 적절한 예방 조치를 취해야합니다. 또한, 에디듐 브로마이드는 알려진 발암물질이며 이 프로토콜을 사용하여 매우 신중하게 처리되어야 한다.
