Nuestro protocolo se puede utilizar para mejorar la calidad y la cantidad de datos de expresión génica generados a partir de muestras de ARN derivadas de FFPE, especialmente en muestras de calidad subóptima. Esta técnica evalúa la calidad del ARN dentro de las muestras de tejido FFPE y permite optimizar su procesamiento posterior para mejorar la cantidad y la calidad de los datos de secuenciación de muestras. Este método permite la caracterización completa de una transcripción en la muestra biológica y clínica y puede proporcionar información sobre los elementos funcionales del genoma en el desarrollo y la enfermedad.
La degradación de FFPE-RNA y la selección de los métodos para el control de calidad de la muestra, la preparación de la biblioteca y el análisis de datos pueden ser muy complicados. Sea meticuloso al seleccionar los métodos adecuados y los controles adecuados. La demostración visual permite a los espectadores observar las pequeñas modificaciones sutiles y precauciones necesarias durante la planificación, la evaluación y el proceso de secuenciación, especialmente para muestras de FFPE mal conservadas.
Para comprobar la calidad de la muestra de ARN, ejecute la muestra en un sistema de CONTROL de ARN de acuerdo con las instrucciones del fabricante y utilice el software de bioanálisis adecuado para analizar la distribución de los fragmentos de ARN dentro de la muestra y para calcular la proporción de fragmentos de más de 100 y 200 nucleótidos. Sobre la base de las métricas de control de calidad, identifique las muestras con menos del 40% de los fragmentos de más de 100 nucleótidos para permitir la exclusión de estas muestras del procesamiento. Para la secuenciación, descongele los kits de reactivos de secuenciación adecuados de acuerdo con los parámetros de carrera en un baño de agua a temperatura ambiente y coloque la bandeja de reactivos a cuatro grados centígrados después de descongelar.
Coloque el paquete de celda de flujo a temperatura ambiente durante 30 minutos. Mientras el paquete se está calentando, abra la aplicación Illumina Experiment Manager y seleccione Crear hoja de muestra. Seleccione el secuenciador que desea utilizar y haga clic en Siguiente.
Introduzca el código de barras del kit de reactivos y los demás parámetros de flujo de trabajo adecuados. A continuación, cargue una hoja de muestra creada según los criterios de secuencia de Illumina. Para preparar la biblioteca de muestras y la biblioteca de control PhiX, desnaturalizar y diluir las bibliotecas a las concentraciones adecuadas y mezclar la muestra y las bibliotecas de control PhiX para obtener una relación de volumen de control de 5%PhiX.
Cuando las células de flujo estén listas, retire el envoltorio, limpie la superficie de vidrio con una toallita de alcohol sin pelusas y seque el vaso con un tejido de laboratorio de pelusas baja. Retire el cartucho de reactivo de un almacenamiento de cuatro grados Celsius e invierta el cartucho cinco veces para mezclar los reactivos. Toque suavemente el cartucho en el banco para reducir las burbujas de aire y cargue la muestra desnaturalizado y diluido en el cartucho de reactivo en el depósito designado.
Cargue la celda de flujo, el cartucho de búfer y el cartucho de reactivo en el sistema. A continuación, realice una comprobación automatizada y revise la salida para asegurarse de que los parámetros de ejecución pasan la comprobación del sistema. Una vez completada la comprobación automatizada, seleccione Iniciar para iniciar la ejecución de secuenciación.
Para visualizar los resultados de control de calidad de preprocesamiento y control de calidad posterior a la alineación, ejecute multi-QC para generar un informe agregado en formato HTML. Para determinar los efectos de lote y evaluar el mapa de calidad del conjunto de datos especificado, utilice un script de R para ejecutar un análisis de componente principal. El análisis de correlación de muestras se puede llevar a cabo utilizando la correlación de Pearson entre diferentes muestras.
La estimación de la proporción de fragmentos de más de 100 nucleótidos es más útil que una estimación de los fragmentos de más de 200 nucleótidos, ya que es más sensible para medir con precisión la proporción de tamaños de fragmentos más pequeños para muestras de ARN altamente degradadas. Dado el alto grado de degradación en el conjunto de muestras, se recomienda un método total de preparación de la biblioteca de ARN. Por ejemplo, aquí se muestran las bibliotecas de secuenciación preparadas a partir de cuatro ejemplos diferentes.
Aquí, se muestran información general sobre la calidad de secuenciación de archivos FastQ sin procesar y el contenido del adaptador de ejemplo. El cribado FastQC puede ayudar a detectar contaminación como contaminación bacteriana o de ratón dentro de las muestras. La alineación STAR se puede utilizar para determinar la proporción de lecturas asignadas al genoma de referencia, el porcentaje de lecturas asignadas de forma única al genoma de referencia y la proporción de lecturas que no se asignaron o que se asignaron a varios loci.
La tarjeta y las estadísticas RSeQC se pueden utilizar para determinar el porcentaje de ARN de mensajería, bases intrónicas e intergénicas presentes en las lecturas asignadas. Para estos análisis representativos, algunas bibliotecas degradadas tenían un sesgo de tres primos en el que se asignaban más lecturas más cerca de los tres primeros que a los cinco finales principales. Además, se puede realizar un análisis de componentes principales para determinar el porcentaje de la variación total capturada por los componentes principales para las réplicas biológicas de cada muestra.
Tenga cuidado de evitar la degradación de la muestra, preparar réplicas y varias capas para cada muestra, utilizar las métricas adecuadas para evaluar la calidad de la muestra y utilizar el método de preparación de la biblioteca adecuado. Utilizando esta metodología, se pueden realizar estudios NGS más grandes con muestras de FFPE previamente inutilizables con diferentes tiempos y condiciones de almacenamiento para obtener información sobre una variedad de diferentes estados de la enfermedad. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores estudien los grandes archivos existentes de muestras de FFPE con información clínica rica y pueden mejorar en gran medida los estudios de cáncer basados en la población.
