Este método puede ayudar a responder preguntas fundamentales sobre la dinámica de las células progenitoras neuronales y su progenie que subyacen al desarrollo cerebral de los vertebrados. La principal ventaja de esta técnica es la capacidad de visualizar directamente múltiples grupos de células relacionadas clonalmente dentro del cerebro vivo durante muchas horas de desarrollo. El protocolo también se puede aplicar al estudio de la dinámica clonal y progenitora en otros sistemas en desarrollo del embrión de pez cebra.
La visualización mediante este método es especialmente útil para observar directamente los procesos fundamentales que se producen durante el desarrollo neuronal. En la tarde anterior a la realización de microinyeccións, establecer peces cebra adultos de tipo salvaje en tanques de apareamiento segregados por sexo. A la mañana siguiente prepare la solución de ADN de acuerdo con las instrucciones del manuscrito e inyecte aproximadamente 4,2 nano litros de esta solución en embriones de pez cebra de una célula dentro de los 45 minutos posteriores a la fertilización.
Mantener los embriones inyectados en E tres medianas y una incubadora de 28 grados Celsius durante 24 horas, luego llamar a los embriones muertos y deformados del grupo. Transfiera hasta 20 embriones sanos a un tubo de 50 mililitros, llénelo con 10 mililitros de E tres y coloque una tapa encima de cada tubo. Coloque un estante con los tubos de 50 mililitros en posición vertical en un baño de agua de 37 grados Centígrados durante 80 a 90 minutos, asegurándose de que el nivel de agua en el baño sea superior al E tres en el tubo.
Retire el portatubos del baño de agua y colóquelo en la incubadora de 28 grados Centígrados. Espere hasta una hora para que el E tres se enfríe y los embriones se vuelvan a reacclimar a la temperatura. Luego transfiéralos a los platos de Petri con 0,2 PTU milimétricas y E tres mantenidos calientes en la incubadora de 28 grados Centígrados.
A las dos o cuatro horas después del choque térmico, examine los embriones bajo un microscopio estándar de disección de fluorescencia para la expresión de CFP o YFP que indica una recombinación exitosa de Brainbow. Seleccione embriones con una expresión de FP robusta y transfiérelos a un plato separado con PTU. Iimagen de uno, dos o tres días después de la fertilización.
La expresión que aparece tenue bajo un microscopio de fluorescencia puede visualizarse bien en imágenes de lapso de tiempo confocal. Antes del día del experimento, prepare la cámara de imágenes y la herramienta de manipulación de embriones. Para preparar la cámara de imágenes, supere cuidadosamente un anillo de plástico al centro de una placa Petri de 60 milímetros.
Construir el manipulador mediante el pegado súper de una pequeña longitud de línea de pesca de nylon hasta el final de un palo de hisopo de madera de cuatro pulgadas. Si es necesario, descorte los embriones bajo un microscopio de disección antes del montaje. Para montar los embriones, transfiera el pez al centro del anillo de plástico en la cámara de imágenes y retire tanto el exceso de E tres como sea posible con una pipeta de transferencia de punta fina.
Utilice una pipeta de transferencia limpia para cubrir el pescado con un uno por ciento de agarosa de bajo derretimiento y E tres, llenando todo el anillo de plástico con una capa de agarosa. A continuación, tire suavemente del embrión hacia arriba en la punta de la pipeta y de nuevo en la agarosa sin introducir ninguna burbuja de aire. Utilice un manipulador embrionario para orientar rápidamente el pescado y la agarosa antes de que se endurezca.
Si realiza una toma de imágenes con un microscopio vertical, coloque el embrión lo más cerca posible de la superficie superior de la agarosa, asegurándose de que sean paralelos a la parte inferior de la cámara de imágenes con la cola recta. Espere a que la agarosa se endurezca, luego llene la cámara de imágenes con E tres, añadiendo tanto como sea posible para explicar la evaporación en el transcurso de la toma de imágenes. Coloque la cámara de imágenes con el pez y E tres en el microscopio confocal.
A continuación, seleccione el objetivo con una apertura numérica alta y una larga distancia de trabajo. Encuentre una región con un etiquetado de celdas adecuadamente denso y brillante y configure los parámetros de adquisición. Este es un ejemplo con el software Zen, pero los ajustes variarán dependiendo del microscopio y las líneas láser disponibles.
Prepare tres pistas para poner una imagen secuencial de cada canal FP. Utilice un láser de argón para excitar CFP a 458 nanómetros y YFP a 514 nanómetros, y utilice un láser de nanómetro DPSS 561 para excitar el dTomato. Recoge las misiones para los tres en las longitudes de onda apropiadas.
Seleccione el rango de pila Z para la imagen y un intervalo de tiempo entre 10 y 30 minutos para realizar un seguimiento de los eventos mitoticos y apoptóticos. Por último, seleccione la duración de la sesión de imágenes y ejecute el experimento. Una vez completada la creación de imágenes, guarde los datos sin procesar en formato CZI si utiliza Zen u otro formato compatible con Fiji y, a continuación, importe las imágenes en Fiji utilizando el importador de formatos biológicos.
Las imágenes de lapso de tiempo multicolor in vivo se utilizaron para mostrar clones codificados por color Brainbow de células en la zona ventricular proliferativa del cerebro trasero del pez cebra en desarrollo. Las células etiquetadas brainbow dispuestas a lo largo de una fibra radial en particular compartían el mismo color. Que se pueden cuantificar como los pesos de canal RGB relativos.
Esto sugiere que estos grupos de radio eran clones de células divisorias y que su color similar podría ser utilizado para identificarlos como relacionados clonalmente. Un análisis cuantitativo del color mostró que las células hijas expresan el mismo color que la célula de su madre. Pero los grupos de radio vecinos de células se pueden distinguir entre sí.
Numerosos clones de células relacionadas se pueden seguir simultáneamente durante horas in vivo, lo que permite un análisis y comparación de linaje multiplex. La cuantificación de la expresión del color en los clones a los dos y luego de nuevo a los tres días después de la fertilización mostró que la expresión de Brainbow se mantuvo relativamente constante de dos a tres días. Las imágenes de lapso de tiempo revelaron numerosas células sometidas a migración nuclear intercinética y división celular de uno a dos días después de la fertilización, lo que permite estudiar el ciclo celular.
Se calculó un ciclo celular promedio de 8,4 horas que es comparable a las mediciones anteriores en peces cebra. Además, esta técnica de imagen se utilizó para observar células individuales sometidas a los cambios morfológicos estereotipados asociados con la apoptosis, como el sangrado de membranas y la fragmentación celular. Debido a que este método se realiza in vivo, el pez cebra puede ser rescatado de la cámara de imágenes y mantenido para imágenes u otros experimentos en puntos de tiempo posteriores.
El uso de esta técnica nos permite explorar nuevas preguntas sobre los roles de las células relacionadas clonalmente durante el desarrollo neuronal.
