Este protocolo facilita el estudio de aminopeptidases con diferentes estados oligoméricos y actividades dependientes de la oligomerización que se equilibran entre los dimers inactivos y los dodecamers activos. Esta técnica convencional se puede realizar fácilmente en cualquier laboratorio. Y además de requerir acceso a una instalación de cristalografía de rayos X o de línea de haz, no requiere dispositivos especiales.
Con alguna adaptación, este método se puede aplicar a cualquier otra proteína con una actividad o función que dependa de su grado de oligomerización. Para procesar los datos de rayos X, los usuarios deben tener una comprensión mínima de la cristalografía. Invitamos a los usuarios a seguir los entrenamientos, a visitar XDS Wiki, y a ver tutoriales de Phoenix.
Para realizar un ensayo de actividad, añadir 25 microlitros de 100 mM de L-Leucina p-Nitroanilida a 965 microlitros de 50 MOPS milimélares, 250 micromolares de cobalto dos cloruro y 10%metanol Pre incubar la mezcla de reacción en un baño seco de 75 grados Celsius, antes de diluir la enzima a una concentración de micromolar final con 50 milivores MOPmolar adicionales. A continuación, añada 10 microlitros de una enzima micromolar a la mezcla de reacción y vórtice la solución resultante antes de devolver la reacción al baño seco de 75 grados Centígrados durante no más de una hora. Cuando la solución se haya vuelto amarilla, detenga la reacción con un mililitro de ácido ácido 20% y vórtice la mezcla antes de permitir que se enfríe a temperatura ambiente.
A continuación, transfiera una alícuota de la mezcla de reacción a una célula espectrofotómetro y lea los absorbentes a 410 nanómetros contra una mezcla de reacción incubada sin enzima, como control negativo. Para la preparación de laspoenzimas, agregue 10 microlitros de 1, 10-fenantrolina solución de stock a 890 microlitros de 50 MOPS milimélares, 0.5 sulfato de amonio molar y 100 microlitros de tmPep1050 purificados. Compruebe la pérdida de actividad utilizando el ensayo de actividad como se ha demostrado sin la adición de cobalto de dos cloruros.
Después del ensayo, transfiera la muestra a un tubo de diálisis y marque la muestra contra 200 mililitros de 50 MOPS mililolares y 0,5 sulfatos de amonio molar a cuatro grados centígrados. Intercambie el dialato con un tampón fresco tres veces durante la diálisis de 48 horas y recoja la muestra del tubo de diálisis. Usando unidades de ultrafiltración con un corte de 30 kilodalton, concentre la muestra de nuevo en 100 microlitros y compruebe la concentración en un espectrofotómetro de nano volumen a 280 nanómetros.
Para preparar los dimers diluir la apoenzima a una concentración de un micromolar en 50 MOPS mililolar y 0,5 sulfato de amonio molar, e incubar la reacción durante dos horas en un baño seco de 75 grados Centígrados. A continuación, concentre la muestra enzimática en la concentración de al menos 50 microlitros y compruebe la cromatografía de exclusión de peso molecular por tamaño. Para mejorar la forma, el tamaño y la cristalinidad de los cristales proteicos, añada el volumen adecuado de solución de cristalización optimizada a una gota de cristal para llevar el volumen de gotas de cristal a 10 microlitros.
Transfiera la gota a un microtubo de 1,5 mililitros y añada 90 microlitros más de solución de cristalización al pozo de semillas. Para cada dilución de semillas, agregue 500 microlitros de reactivo de cristalización por pozo al número adecuado de pozos en una placa de cristalización y mezcle dos microlitros de muestra de proteína con dos microlitros de reactivo de cristalización y 0,2 microlitros de semillas en un soporte de cristalización por pozo. A continuación, fije los soportes a cada pozo de reactivo de cristalización.
Para la recolección de cristales, llene un baño con nitrógeno líquido y sumerja los viales o la cesta utilizados para la manipulación de muestras en el nitrógeno. El manejo de nitrógeno líquido es peligroso puede causar congelaciones severas. Asegúrese de usar protecciones individuales adecuadas como guantes criogénicos y gafas protectoras para los ojos.
Configure bucles de selección de muestras de diferentes tamaños según el tamaño del cristal y utilice un binocular para seleccionar una gota que contenga cristales. A continuación, utilice un bucle para seleccionar suavemente un cristal aislado de un pozo e inmediatamente sumerja el bucle en nitrógeno líquido antes de colocar el bucle en un vial adecuado. Para medir las intensidades de punto de difracción, cree una carpeta desde la que se ejecutará XDS y localice la ruta de acceso a las imágenes.
Para ejecutar xdsme, introduzca el comando en una ventana de terminal. Una vez finalizado XDS, compruebe el archivo lp correcto y anote la probabilidad de la determinación del grupo espacial, la integridad de los datos, la resolución más alta, la mosaico de cristales y la calidad de los datos. Después de comprobar el registro sin sentido XDS para obtener la probabilidad de grupos de espacio, utilice los comandos para volver a ejecutar xdsme con diferentes soluciones de grupos de espacio propuestas por XDS, en una carpeta independiente para evitar reemplazar el proceso anterior.
Después de seleccionar la mejor solución basada en las estadísticas de datos, escriba los comandos para ejecutar XSCALE y XDSCONV. Para determinar la fase sin un elemento de dispersión anómalo, utilice coordenadas 4P X, Y, para preparar el modelo inicial para el reemplazo molecular. Desde el archivo PDB, utilice el editor de archivos Phenix PDB para extraer el monómero A y truncar sus aminoácidos en alanina.
Ejecute X triaged con el archivo de reflexión generado por XDSCONV y la secuencia como entradas. Compruebe el archivo de registro de Xtriage. Tenga en cuenta la integridad, el número de subunidades en la unidad asimétrica, la anisotropía, la presencia de anillos de hielo y la ocurrencia de hermanamiento.
Para ejecutar Phaser-MR en Phoenix para su reemplazo molecular, seleccione el archivo de reflexión, la secuencia y el modelo 4P seis Y inicial truncado en polialanina y haga clic en Ejecutar. al finalizar, compruebe si se ha encontrado un modelo y compruebe la puntuación del reemplazo molecular. Una puntuación Z del factor de traducción de al menos ocho, indica que la solución es definitivamente correcta.
Después de determinar la fase por reemplazo molecular, seleccione Ejecutar compilación automática y haga clic en Ejecutar. Todos los archivos necesarios se añadirán automáticamente. Al finalizar, compruebe el modelo en COOT y construya y refina el modelo manualmente, de acuerdo con el mapa de densidad de electrones en COOT.
Usando este modelo, la secuencia y los datos de difracción como entradas, refinar el modelo curado manualmente en Phoenix, refiriéndose a Phoenix para ayudar a seleccionar la estrategia correcta. Después de la comprobación de refinamiento de los resultados, el trabajo libre de refinamiento y refinamiento debe disminuir. Los indicadores MolProbity deben ser respetados y los valores atípicos con baja correlación de espacio real, deben ser limitados.
Cuando se haya generado el mejor modelo refinado, ejecute MolProbity en el servidor y compruebe los valores atípicos identificados por el programa. La cromatografía de exclusión de tamaño se puede utilizar para determinar el peso molecular aparente de la proteína purificada. La condición de cristalización del péptido, se puede optimizar variando el pH frente a la concentración de PEG alrededor de la condición del dimer.
Por ejemplo, los mejores cristales tmPep1050 H60A H307A, se obtuvieron en citrato de sodio molar 0.1 con un pH de 5.2 y 20%PEG 3350 de concentración, después de un ciclo de micro siembra para mejorar la micro cristalinidad. En este análisis, la indexación de datos mostró que el grupo espacial del cristal TmPep1050 H60A H307A era C2221, pero XDS propuso otra solución, el grupo espacial MP. La estructura de TmPep1050 H60A H307A, podría completarse después de varios ciclos de refinamiento automatizado y manual.
Confirmando el estado oligomérico con una superficie de interfaz de 1.710 angstroms cuadrados entre ambos monómeros y una energía libre de formación de interfaz de menos 16,2 kilocalorías por lunar. Aquí, se puede observar un primer plano del sitio activo TmPep1050 H60A H307A en comparación con el sitio activo del dimer TmPep1050 y dodecamer. Al construir un modelo, tenga cuidado de construir solo lo que se ve en la densidad de electrones para evitar la interpretación excesiva, los datos y tomarse el tiempo para pulir su modelo.
El peso molecular del dimer y el dodecamer también se puede determinar mediante espectrometría de masas nativa. Y los métodos pueden ser útiles para detectar oligómeros de transición.
