Este protocolo permite la formación de células tumorales metastásicas cerebrales y la generación de cortes cerebrales ex vivo que permiten realizar pruebas rápidas de la eficacia del fármaco y la radiación en un tumor preformado. La principal ventaja de esta técnica es la capacidad de probar rápidamente múltiples medicamentos o tratamientos en un entorno fisiológicamente relevante que mantiene las interacciones cerebro-tumor-huésped. Este método puede ayudar a comprender cómo las células metastásicas cerebrales crecen, sobreviven e invaden el parénquima cerebral y comprender el papel del microambiente tumoral cerebral en el crecimiento y la propagación del cáncer.
Demostrando el procedimiento estarán Lorela Ciraku y Emily Esquea, ambas candidatas a doctorado de mi laboratorio. Para empezar, coloque los ratones anestesiados en un marco estereotáxico e inmovilice la cabeza con barras auditivas estándar. Esterilizar la superficie de la cabeza tres veces mediante la aplicación alterna repetida de hisopos de yodo y etanol al 70% antes de la incisión.
Usando un bisturí quirúrgico, haga una incisión de línea media de un centímetro en un ángulo diagonal con respecto al eje imaginario que divide el cerebro de los ratones en dos mitades simétricas para exponer el cráneo. Después de limpiar cualquier sangre con un hisopo de algodón, desvíe la piel lateralmente para exponer el sitio de inyección. Use una broca de rebaba de 0,73 milímetros para penetrar en el cráneo y perfore un orificio con una ligera presión y movimiento de torsión.
Para inyectar cinco microlitros de células que expresan de manera estable la luciferasa GFP, inserte una jeringa de alta precisión a 3,5 milímetros de profundidad en el cerebro. Deje que se asiente durante dos minutos y luego tire de la jeringa hacia arriba aproximadamente un milímetro. Después de dos minutos, inyecte lentamente el primer volumen medio y espere otros dos minutos antes de inyectar el resto del volumen.
Después de tres minutos, tire lentamente de la jeringa. Aplique cera ósea en el sitio de inyección en el cráneo y suture el tejido con suturas de polipropileno. Monitoree el comportamiento del ratón inmediatamente después de la cirugía periódicamente para determinar si se necesita un tratamiento especial, incluida la inyección de solución salina y alimentos blandos, para ayudar a una recuperación rápida.
Para monitorear el crecimiento del tumor a través de imágenes de bioluminiscencia, primero encienda el oxígeno y el isoflurano en el sistema de imágenes y permita que ambos se distribuyan a la cámara separada fuera de la caja de imágenes. Luego, después de encender el software e inicializar el instrumento, elija la opción adecuada para visualizar y capturar todo el cuerpo del mouse. A continuación, transfiera los ratones a la cámara fuera de la caja de imágenes suministrada con oxígeno e isoflurano.
Una vez que los ratones estén bajo el efecto anestésico, inyecte a los ratones por vía intraperitoneal con 200 microlitros de 30 miligramos por mililitro de luciferina. Coloque a los ratones en la cámara de imágenes con el estómago hacia abajo hasta el labio nasal de las cámaras de imágenes. Bloquee la cámara, elija dos minutos de exposición para iniciar la toma de imágenes y luego complete la imagen.
Después de colocar la cortadora de tejido en una campana de flujo laminar estéril, limpie todas las herramientas e instrumentos con etanol al 70%. Después de sacrificar al ratón, retire y coloque el cerebro rápidamente en una solución helada de sacarosa-ACSF. Usando una espátula, transfiera el cerebro en un papel de filtro humedecido por ACSF en una tapa de plato de 60 milímetros.
Usando una cuchilla de afeitar afilada y estéril, corte las partes sobrantes del cerebro que no contienen ningún tumor, incluida la parte inferior del cerebro, para llevar la forma del cerebro a un cubo no perfecto. Después de colocar varias hojas de papel de filtro humedecido con ACSF en la plataforma de corte, coloque el pañuelo bloqueado sobre el papel de filtro. Para cortar el tejido en secciones de 200 a 250 micrómetros de grosor, establezca el tamaño de corte en 2 o 2.5 unidades en la regla del proveedor y comience a cortar.
Use un pincel para transferir rodajas de cerebro a un plato que contenga sacarosa-ACSF y separe las rodajas bajo un microscopio de luz con agujas de calibre 27. Identifique las rodajas GFP positivas bajo el microscopio fluorescente. Luego, utilizando una pipeta rota estéril de un mililitro con una abertura ancha, transfiera las rebanadas identificadas a un nuevo plato de 60 milímetros que contenga de dos a tres mililitros de medios de rebanadas para adultos.
Luego, transfiera de tres a cinco rebanadas en cada inserto de cultivo de tejido en cada pocillo de una placa de seis pocillos a una distancia segura. Después de retirar el exceso de medio de la superficie del inserto, agregue un mililitro de medio de corte de ratón adulto equilibrado debajo de cada inserto. Incubar los tejidos a 37 grados centígrados, 5% de dióxido de carbono y 95% de humedad durante 24 horas antes de la toma de imágenes.
Pipetee cinco microlitros de 30 miligramos por mililitro de solución de luciferina en el medio debajo de los insertos dentro de una campana estéril. Coloque la placa de seis pocillos con la tapa dentro de la cámara de imágenes del instrumento debajo de la cámara estacionaria y cierre la puerta de la cámara. Abra el software e inicialice el instrumento.
Después de elegir la configuración de la cámara que permite la visualización y captura de solo un pozo por imagen, coloque el pozo para obtener la imagen directamente debajo de la cámara. Use la herramienta de ROI, colóquela alrededor de la forma y el tamaño del tumor, mida el ROI e informe las lecturas totales para cuantificar la señal bioluminiscente de cada tumor en la rebanada. Después de llevar la placa de vuelta a la campana de flujo laminar estéril, use fórceps para levantar ligeramente el inserto del pozo.
Después de aspirar el medio, reemplace el medio con un mililitro de medio fresco y coloque el recuadro de nuevo en el pozo. Para los experimentos en los que las rebanadas se tratan con varios compuestos, como inhibidores y metabolitos, prepare la concentración de reactivo adecuada en 1,2 mililitros de medios de rebanadas cerebrales en un tubo de 1,5 mililitros, y luego transfiera un mililitro de reactivo al pozo que contiene la rebanada. Las células de luciferasa BR-GFP MDA-MB-231 se inyectaron en ratones desnudos, se permitió que los tumores crecieran, los cerebros con tumores se diseccionaron, se cortaron, se cultivaron ex vivo y el crecimiento del tumor se monitoreó mediante imágenes de bioluminiscencia.
La tinción de H&E y la fluorescencia GFP positiva confirmaron la presencia de un tumor en la rebanada del cerebro. El aumento de la tinción de Ki-67 confirmó la presencia de células cancerosas altamente proliferativas. Los tumores en rebanadas cerebrales que no fueron expuestas a la irradiación continuaron creciendo ex vivo, mientras que los tumores expuestos a la irradiación mostraron un crecimiento estancado.
Las rebanadas cerebrales que contenían tumores también se monitorearon a través de imágenes en vivo para visualizar el crecimiento del tumor después del tratamiento de irradiación. De acuerdo con las imágenes bioluminiscentes, las células cancerosas de control crecieron rápidamente a medida que aumentaba la intensidad de la GFP y las células comenzaron a invadir el parénquima cerebral. Por el contrario, las células cancerosas en las rebanadas cerebrales tratadas con irradiación fueron citostáticas y se mantuvo la intensidad de la GFP.
Se detectaron grandes células cancerosas multinucleadas y un aumento en la tinción del marcador de daño del ADN en las células cancerosas tratadas con IR. Además, se detectó un aumento de los astrocitos reactivos. La apoptosis inducida por el tratamiento IR no se detectó en las rebanadas cerebrales de ratón libres de tumor.
Las rebanadas cerebrales que contenían tumores se trataron con diferentes concentraciones de paclitaxel, un fármaco quimioterapéutico. El tratamiento disminuyó significativamente el tamaño del tumor después del día 10 de tratamiento. Se detectó un aumento de la apoptosis en las células tumorales tratadas con paclitaxel.
El tratamiento con inhibidores no alteró la viabilidad del tejido cerebral. No se midió ningún aumento en la apoptosis por tinción de caspasa-3 escindida en una rebanada de cerebro de ratón libre de tumores tratada con paclitaxel. Cuando el tratamiento con los fármacos de interés ha finalizado, se pueden analizar las rebanadas para la expresión proteica mediante inmunocitoquímica, estudios ómicos, o lograr una suspensión unicelular adecuada para la citometría de flujo.
