Nuestro protocolo es compatible con otros métodos de análisis molecular y permite evaluar cómo los fármacos afectan la viabilidad de las rebanadas de tejido en tacto y el rendimiento del cribado de rendimiento medio. La principal ventaja de esta técnica es que podemos medir la viabilidad de una rebanada de tejido entera en tiempo real con muy poco pre-o post-procesamiento. Esta técnica acelera el desarrollo de fármacos preclínicos y la oncología mediante la prueba de los candidatos a medicamentos o las rebanadas de tejidos adquiridas directamente a partir de muestras de tejido tumoral del paciente.
Nuestro método de evaluación de la viabilidad tisular en tiempo real es bastante versátil y se puede aplicar a la biología del cáncer, la neurociencia y los estudios de biología del desarrollo. Preparar rebanadas de tejido viables en el tacto es la clave para el éxito del procedimiento. Los ajustes de Vibratome en composición media deben ajustarse de acuerdo con el tipo de tejido y la firmeza.
El día de la adquisición de la rebanada de tejido tumoral, aliquot 250 microlitros de medio de cultivo de corte de tejido por pozo en una placa de 24 pozos y colocar un inserto de cultivo de tejido en cada pozo. A continuación, coloque la placa en una incubadora humidificada de 37 grados Centígrados con un cinco por ciento de dióxido de carbono hasta su uso. Para adquirir fragmentos de tejido tumoral, sumerja el tejido tumoral en el HBSS helado en una placa de cultivo de 10 centímetros y use un bisturí para cortar el tejido por la mitad.
Utilice un punzón de biopsia de seis milímetros para adquirir cilindros del tejido tumoral y recortar un extremo de cada cilindro para crear una superficie plana. Coloque las piezas de tejido en un HBSS fresco y helado y encienda un Vibratome. Desinfecte todo el equipo con el setenta por ciento de etanol y coloque la bandeja tampón Vibratome, cubierta con una tapa de vidrio acrílico, en el centro del baño de hielo Vibratome.
Agregue hielo al baño, llene la bandeja tampón con HBSS frío. Cargue una cuchilla de afeitar en el soporte de la cuchilla y use fórceps dentados para seleccionar cuidadosamente una muestra de tumor perforada por biopsia. Agregue una gota de pegamento de cianoacrilato de grado médico en la placa de la muestra.
Coloque el tejido en un pedazo de toalla de papel libre de pelusas para eliminar cualquier exceso de tampón y monte el cilindro de tejido en la gota en una posición vertical y estable. Después de dos o tres minutos de secado por aire, coloque la placa en la bandeja tampón y agregue HBSS adicional a la bandeja hasta que el tejido esté completamente sumergido en el tampón. A continuación, monte el Vibratome colocando el conjunto de la bandeja de hielo y la bandeja tampón en el Vibratome y bloqueando el brazo.
Establezca el espesor de corte de Vibratome en 250 micrómetros, la amplitud a tres milímetros, la velocidad de corte a 0,01 a 0,25 milímetros por segundo y el ángulo de la hoja a 15 a 21 grados. Establezca las ubicaciones inicial y final de la hoja y ajuste la altura del escenario. Ejecute el instrumento en modo continuo para cortar rodajas durante varios ciclos hasta que los tejidos se corten uniformemente.
Utilice un bípedo de transferencia de punta ancha para transferir las rebanadas y una pequeña cantidad de HBSS en inserciones de cultivo celular individuales en cada pozo de la placa de 24 pozos previamente preparada y utilice un bípedo de transferencia de punta fina para eliminar cualquier exceso de tampón de los pozos. Cuando se haya alcanzado el final de la muestra, monte un nuevo trozo de tejido y obtenga rodajas adicionales hasta que se hayan adquirido suficientes muestras. Luego cultiva las rebanadas de tejido en la incubadora de cultivo celular durante 24 a 48 horas.
Para medir la viabilidad de las rodajas de tejido, prepare un reactivo de medición de viabilidad basado en luminiscencia que contenga tanto la luciferasa como la prosustura de una a mil dilución en el medio de cultivo de la rebanada de tejido fresco de acuerdo con las instrucciones del fabricante y reemplace el medio en cada pocórico de la placa de 24 pozos por la mezcla. Agregue 50 microlitros de mezcla de sustrato enzimático en cada rebanada de tejido y coloque la placa en un agitador orbital dentro de una incubadora humidificada con agitación suave a 37 grados Celsius y cinco por ciento de dióxido de carbono durante la noche. A la mañana siguiente, mida la señal de luminiscencia en cada pozo en un lector de microplacas utilizando los ajustes adecuados.
Después de determinar la viabilidad basal de las rebanadas de tejido, disolver los fármacos de interés en el medio de cultivo de la rebanada de tejido para obtener soluciones de 10x y añadir cada solución de fármaco 10x al medio de cultivo en la parte inferior de cada sector de tejido bien. Transfiera 50 microlitros del medio suplementado con el medicamento desde la parte inferior de cada pozo en cada rebanada de tejido y devuelva las rodajas al agitador orbital durante la noche. A la mañana siguiente, transfiera la placa de cultivo a la incubadora de subculturas sin agitar y mida la intensidad luminiscente en cada muestra de tejido en el lector de microplacas en los puntos de tiempo experimentales adecuados.
La viabilidad de los tejidos tumorales tratados en cada punto de tiempo se puede calcular utilizando la ecuación como se indica. La viabilidad de las rebanadas de tejido preparadas a partir de una muestra de tumor de cáncer de mama de ratón se puede mantener durante al menos 21 días con intercambios medios ocasionales. El tratamiento con el inhibidor de la multiquinasa durante cuatro días reduce la intensidad de la señal de luminiscencia 100 veces en comparación con el control de los tejidos tumorales tratados con dimetilslfóxido.
El tratamiento con la mitad de la concentración del mismo inhibidor disminuye la luminiscencia ya en el primer día y alcanza el nivel más bajo en el cuarto día, permaneciendo bajo para cada punto de tiempo medido posterior. Por el contrario, la intensidad luminiscente del grupo de tejido tumoral controlado permanece estable durante todo el cultivo de seis días. Además, el tratamiento de las rebanadas tumorales de cáncer de mama de ratón con dosis seriales del inhibidor durante cuatro días ilustra los cambios dependientes de la dosis en la viabilidad de la rebanada en la concentración efectiva media máxima de la droga.
Los xenoinjertos derivados del paciente tratados con doxorubicina, un medicamento quimioteráutico estándar, también presentan cambios en la viabilidad dependientes de la dosis. Además, la prueba de diecisiete fármacos preclínicos y clínicamente aprobados en triplicado en rodajas de tejido preparadas a partir de un único xenoinjerto derivado del paciente a granel proporciona una prueba de concepto de que el cribado de fármacos de rendimiento medio se puede realizar en rodajas tumorales con el microambiente tumoral nativo. Al preparar las muestras de tejido tumoral, tenga cuidado de minimizar el contacto con las rebanadas de tejido para evitar dañar el tejido.
Nuestro método se puede combinar con otros enfoques como IHC, citometría de flujo o secuenciación de una sola célula, para obtener información espacial y de una sola célula de los tejidos. Nuestra técnica permite probar los efectos de múltiples fármacos de interés en diversas dosis en condiciones fisiológicas a lo largo del tiempo. Cuando prepares rebanadas de tejido de tumores con un estado de patógeno desconocido, asegúrate de realizar todos los procedimientos en un gabinete de bioseguridad.
