Este protocolo es significativo para la producción de organoides epiteliales de memoria que se generan sin paso. La principal ventaja de esta técnica es que los organoides se pueden aislar del tejido mamario y de memoria humano y de ratón después de la digestión enzimática. Realizamos una serie de pasos de centrifugación diferencial que aíslan organoides epiteliales sin tener que pasar células.
Una persona que realiza esta técnica puede enfrentar desafíos al incrustar los tejidos en colágeno o matriz y colocarlos dentro de una placa de 96 pocillos. Además, el uso de colágeno adecuadamente polimerizado y el revestimiento de cúpulas estables es la clave para ver la invasión. Para comenzar, recolecte el tejido mamario de un ratón sacrificado extendiendo las extremidades del ratón y usando cuatro agujas de calibre 19, fije al ratón por las patas a una tabla cubierta con una almohadilla absorbente con el lado ventral hacia arriba.
Rocíe con etanol al 70% para suavizar el pelaje y desinfectar la piel y limpiar las heces con una gasa o pañuelo de papel. Comenzando justo por encima de la región anogenital, corte hacia arriba desde la línea media con tijeras quirúrgicas teniendo cuidado de no perforar el peritoneo. Al llegar a la barbilla, haga cortes laterales por ambas clavículas y por las patas traseras y fije la piel del ratón tensa a la tabla para exponer las almohadillas de grasa mamaria.
Después de localizar las almohadillas de grasa mamaria inguinal y torácica en ratones de tipo salvaje, use fórceps para elevar la almohadilla de grasa mamaria. Usando el extremo romo de las tijeras romas afiladas, cree un bolsillo debajo de la almohadilla de grasa mamaria lejos de la piel y corte la almohadilla de grasa mamaria en una pieza completa. Una vez que se hayan retirado las almohadillas de grasa mamaria, enjuague en PBS antes de colocarlas en una placa de cultivo de tejido estéril y luego transfiéralas rápidamente a una campana de cultivo de tejidos.
Picar los tumores mamarios con un bisturí número 10 o número 11 para aflojar el tejido hasta que alcance una consistencia pastosa. Transfiera el tejido picado a un tubo cónico que contenga de 10 a 30 mililitros de solución de colagenasa con un bisturí. Para asegurarse de que se recoge todo el tejido, pipetear un mililitro de solución de colagenasa en la placa de cultivo de tejidos y de nuevo en el tubo cónico.
Coloque el tubo cónico en una incubadora de agitación de sobremesa hasta que el tejido se vuelva fibroso y la solución de colagenasa se vuelva turbia. Girar 50 mililitros de solución durante cinco a 10 minutos a 1.500 RPM. Aspire sobrenadante, y agregue 12 mililitros del medio basal y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo tres o cuatro veces o gire suavemente la muñeca mientras sostiene el tubo 15 veces.
Una vez más, gire el sobrenadante de aspirado, agregue el medio basal y mezcle por pipeteo o rotación del tubo como se demostró anteriormente. Una vez que los fragmentos de tejido más pesados se depositan en el fondo, recoge el sobrenadante con una pipeta serológica y transfiérelo a un tubo cónico de 15 mililitros. Después de cada centrifugación, asegúrese de que el pellet se vuelva cada vez más opaco.
Alícuota suspensión apropiada de organoides en tubos de microcentrífuga de acuerdo con la densidad de organoides en relación con la cantidad de BECM por pocillo. Centrifugar los tubos de microcentrífuga durante 10 minutos a 300 G a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante de los tubos. Mover los tubos con gránulos organoides al hielo y añadir el volumen adecuado de BECM a cada tubo de microcentrífuga.
Pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo para resuspender los organoides en BECM, teniendo cuidado de no producir burbujas. Pipetear lenta y cuidadosamente los organoides suspendidos BECM sobre la superficie de recubrimiento y llenar todos los pocillos vacíos con PBS para mantener la humedad. Coloque la placa en una incubadora de 37 grados centígrados durante una hora para permitir que BECM se solidifique y luego cubra con el volumen apropiado de medios.
Para preparar la solución de colágeno, combine 375 microlitros de 10 veces la concentración de DMEM, 100 microlitros de un hidróxido de sodio normal y tres mililitros de solución de colágeno I de cola de rata en un tubo cónico de 15 mililitros. Mezcle la pipeta, teniendo cuidado de no hacer burbujas, y titule la solución a un pH de 7.2 a 7.4 con una pequeña cantidad de hidróxido de sodio o 10 veces la concentración de DMEM según sea necesario. Cubra el fondo de los pocillos con la cantidad mínima de colágeno requerida para cubrir completamente el fondo del pozo colocando una pequeña cantidad de colágeno y balancee la placa de lado a lado para cubrir.
Permita que las capas base de colágeno se fijen a 37 grados centígrados durante 30 minutos a dos horas. Alícuota la suspensión apropiada de organoides en tubos de microcentrífuga de acuerdo con la densidad organoide relativa a la cantidad de colágeno por pocillo. Almacene la solución de colágeno a cuatro grados centígrados y controle la polimerización verificando la formación de fibra bajo un microscopio cada 10 minutos.
Centrifugar los tubos de microcentrífuga a 300 G durante 10 minutos a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante de los tubos. Mueva los gránulos organoides al hielo y agregue el volumen apropiado de colágeno a cada tubo de microcentrífuga. Pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo para resuspender los organoides en colágeno, teniendo cuidado de no producir burbujas.
Pipetear lenta y cuidadosamente los organoides suspendidos de colágeno sobre la superficie de recubrimiento. Las imágenes inmunofluorescentes de organoides incrustados en la matriz extracelular basal o en el colágeno se obtuvieron para estudiar las similitudes de composición tisular entre especies. Los organoides incrustados en la matriz de colágeno se pueden usar para un ensayo de invasión y analizarse mediante el seguimiento de la expansión de los zarcillos que se ramifican desde el organoide mismo, ya sea a través del etiquetado de tomate de membrana o la tinción de faloidina de actina.
Por último, la tinción con hematoxilina y eosina de organoides incrustados en parafina muestra que los organoides mantienen la misma histología del cáncer de mama. Es crucial mantener el BECM y el colágeno fríos mientras se pipetean las cúpulas gelificadas para evitar la polimerización prematura. Además, la fijación prolongada de domos en PFA conducirá a una solución gelificada si se realiza una tinción inmunofluorescente.
Los organoides también se pueden usar en procedimientos in vitro e in vivo, como pantallas de drogas y modelos de metástasis en ratones. Estos métodos pueden proporcionar información sobre la sensibilidad terapéutica del tejido tumoral, las propiedades metastásicas y las interacciones inmunitarias.
