El protocolo descrito aquí proporciona un método integrador que combina ensayos microbiológicos clásicos con imágenes en vivo de una sola célula para caracterizar las células persistentes de Escherichia coli después de un tratamiento con alto contenido de ofloxacina. La principal ventaja de esta técnica es analizar el fenómeno de persistencia a nivel poblacional y unicelular. La combinación de análisis poblacional y unicelular permite la caracterización molecular y celular del fenotipo de persistencia.
Para comenzar, raye la cepa bacteriana de interés de un stock de glicerol congelado en una placa de agar LB e incube a 37 grados centígrados durante la noche durante un período de 15 a 19 horas para obtener colonias individuales. Inocular una colonia aislada en un tubo de vidrio que contenga cinco mililitros de medio de crecimiento MOPS suplementado con 0,4% de glucosa y, si es necesario, agregue un antibiótico selectivo al medio. Coloque el tubo en una incubadora agitadora a 37 grados centígrados y 180 rpm durante la noche.
Al día siguiente, centrifugar un mililitro de cultivo a 2, 300 g durante tres minutos para granular las células, y resuspender suavemente el pellet con el mismo volumen de PBS. Mida el OD a 600 nanómetros, y calcule el volumen necesario para un OD600 inicial de 0,01 en un volumen final de dos mililitros. A continuación, agregue dos mililitros de glicerol MOPS 0.4% medio en un pocillo de una placa de fondo transparente de 24 pocillos e inocule con el volumen de cultivo calculado durante la noche.
Coloque la placa de 24 pocillos en un lector automático de microplacas para monitorear el OD600 durante 24 horas. Configure el lector de microplacas para medir el OD600 cada 15 minutos a una temperatura de 37 grados centígrados y con una alta rotación orbital de 140 rpm. Derrita 100 mililitros de agar LB y almacene el matraz a 55 grados centígrados para evitar la solidificación.
Preparar seis matraces de vidrio pequeños y pipetear cinco mililitros de agar medio líquido LB en cada matraz con una pipeta estéril. Tome 10 microlitros de los cinco miligramos por mililitro de solución madre de loxacina y diluya en 90 microlitros de agua ultrapura. Agregue volúmenes crecientes de ofloxacino diluido a cada uno de los seis matraces de vidrio que contienen medio de agar LB para obtener una concentración final de cero a 0.1 microgramos por mililitro de ofloxacina.
Mezcle la solución girando los matraces varias veces y vierta los medios de agar LB agregados con antibióticos en una placa de cultivo de seis pocillos. Deje que el agar se enfríe hasta que se solidifique y seque la placa antes de usarla. Diluir un cultivo bacteriano durante la noche a una densidad celular final de una vez 10 a la séptima UFC por mililitro con PBS.
Coloque dos microlitros de cultivo diluido en cada pocillo de la placa seca de seis pocillos. Deje que las manchas se sequen antes de colocar la placa en una incubadora a 37 grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, compruebe en qué concentración de ofloxacino se inhibe el crecimiento de colonias de bacterias.
Vierta aproximadamente 25 mililitros del agar LB preparado en una placa de Petri. Luego agregue de cinco a ocho perlas de vidrio estériles a cada plato solidificado y seco. Invierta y etiquete las placas.
A continuación, prepare diez veces tubos de vidrio de dilución en serie que contengan 900 microlitros de solución de sulfato de magnesio 0.01-molar. En un tubo de vidrio, diluir un cultivo nocturno en medio fresco y ajustado a la temperatura hasta un OD600 final de aproximadamente 0.001, y permitir que el cultivo crezca durante la noche en una incubadora. Al día siguiente, cuando el OD600 alcance 0.3, transfiera 100 microlitros del cultivo para su dilución de acuerdo con los datos del ensayo puntual.
Realizar una dilución en serie diez veces mayor del cultivo bacteriano. Luego coloque 100 microlitros del cultivo diluido en las placas de agar LB preparadas. Agregue la concentración deseada de ofloxacino en el cultivo bacteriano y continúe incubando a 37 grados centígrados mientras agita.
En los puntos de tiempo relevantes, retire 100 microlitros del cultivo y diluya el cultivo de acuerdo con los datos del ensayo puntual. Placa 100 microlitros del cultivo diluido en las placas de agar LB. Al día siguiente, cuente las colonias de las placas incubadas durante la noche en las dos diluciones más altas para las cuales se pueden detectar colonias.
Calcule la relación de supervivencia normalizando la UFC por mililitro en cada punto de tiempo en la UFC por mililitro en T0, y trace el valor normalizado de la base logarítmica 10 en función del tiempo. Retire la solución de conservación de cada pocillo de la placa microfluídica y reemplácela con un medio de cultivo fresco. Selle la placa microfluídica con el sistema de colector haciendo clic en el botón Sello o a través del software microfluídico.
A continuación, en la interfaz del software microfluídico, realice una primera secuencia de cebado haciendo clic en Ejecutar secuencia de cebado líquido. Incubar la placa en un gabinete controlado termostáticamente del microscopio a 37 grados centígrados durante un mínimo de dos horas antes de comenzar la toma de imágenes de microscopía. Luego comience una segunda secuencia de cebado líquido de ejecución antes de comenzar el experimento.
Selle la placa microfluídica haciendo clic en Dessellar placa en la interfaz del software microfluídico. Reemplace el medio en los pocillos con 200 microlitros de medio fresco, medio fresco que contenga antibióticos, y 0.01 OD de muestra de cultivo diluido en el medio fresco. Después de sellar la placa microfluídica como se demostró anteriormente, coloque la placa en el objetivo del microscopio dentro del gabinete del microscopio.
En el software microfluídico, haga clic en Ejecutar secuencia de carga de células para permitir la carga de las células en la placa microfluídica. Establezca un enfoque óptimo utilizando el modo de luz transmitida y seleccione varias regiones de interés donde se pueda observar un número de celda apropiado de hasta 300 celdas por campo. En el software microfluídico, edite la secuencia Ejecutar una secuencia personalizada para programar la inyección de medio fresco a 6,9 kilopascales durante seis horas a los pozos uno y dos, seguido por el medio que contiene antibiótico a 6,9 kilopascales o seis horas al pozo tres, y finalmente el medio fresco a 6,9 kilopascales durante 24 horas a los pozos cuatro y cinco.
Realice imágenes de microscopía en modo de lapso de tiempo con un fotograma cada 15 minutos utilizando luz transmitida y la fuente de luz de excitación para el reportero fluorescente, e inicie el programa microfluídico. Abra el software ImageJ o Fiji en el equipo y arrastre las imágenes de microscopía de lapso de tiempo hyperstack a la barra de carga de Fiji. Utilice Imagen, seguido de Color y, a continuación, Crear compuesto para fusionar los diferentes canales de la hiperpila.
Utilice Imagen, Color y, a continuación, Organizar canales si los canales no corresponden al color deseado. Abra el complemento MicrobeJ y detecte las células bacterianas utilizando la interfaz de edición manual. Elimine las celdas detectadas automáticamente y describa manualmente las celdas persistentes de interés fotograma a fotograma.
Después de la detección, utilice el icono Resultado en la interfaz de edición manual de MicrobeJ para generar una tabla ResultJ. Utilice la tabla ResultJ para obtener información sobre los diferentes parámetros de interés del análisis de celda única y guarde el archivo ResultJ. Se determinó que la CMI de ofloxacino para ambas cepas era de 0,06 microgramos por mililitro, lo que indica que la fusión hupA-mCherry no afectó la sensibilidad de la ofloxacina en comparación con la cepa isogénica de tipo salvaje.
El ensayo puntual mostró clones aislados en diluciones apropiadas a lo largo del tiempo, por ejemplo, de 10 a la quinta dilución negativa en el tiempo cero. En el ensayo de tiempo de muerte, se observó una curva bifásica típica donde la primera pendiente refleja la rápida matanza de la población no persistente. La segunda fase mostró una tasa de mortalidad más lenta, revelando la presencia de células persistentes tolerantes a los medicamentos.
En particular, la curva de tiempo de muerte muestra que la proteína de fusión hupA-mCherry no afectó la cinética de muerte de tiempo. En el experimento microfluídico, la primera fase de crecimiento indica que las células eran viables y se dividían antes del tratamiento con ofloxacino. Después de esta primera fase de crecimiento, la división celular se bloqueó tan pronto como el antibiótico llegó a las células.
Después del tratamiento con ofloxacino, en perfusión con medio fresco, la gran mayoría de las células no pudieron reanudar el crecimiento. En contraste, una pequeña subpoblación podría alargarse y generar células filamentosas, que se definen como las células persistentes. El filamento persistente en división generó múltiples células hijas, la mayoría de las cuales comenzaron a crecer y dividirse de manera similar a las células no tratadas.
El aumento en la longitud celular se correlacionó con un aumento en la intensidad total de fluorescencia mCherry, lo que refleja el reinicio de la replicación y un aumento en la abundancia de nucleoides. Cuando se usa una cepa que contiene un reportero intracelular para estudiar la persistencia, es imperial que la presencia del reportero no interfiera con el crecimiento, la CMI y la muerte en comparación con una cepa de tipo salvaje. El procedimiento descrito aquí se puede aplicar a otras condiciones y especies de bacterias para monitorear las respuestas celulares a entornos cambiantes o tensiones.
Mediante el uso de otros reporteros fluorescentes en una configuración idéntica, se pueden probar nuevos conocimientos sobre la fisiología de las células persistentes.
