PBMC- und Plasmaproben sind einfach zu erwerben und in der frühen klinischen Entwicklung sehr informativ. Dieses robuste Protokoll minimiert die präanalytische Variabilität, die an klinischen Standorten eingeführt wird. Dieses Protokoll ist schnell und einfach und erfordert grundlegende Laborausrüstung und minimales Bedienerwissen, um das Blut zu PBMCs und Plasma zu verarbeiten.
Es ist kompatibel mit geschäftigen Labortagen in Krankenhäusern. Die nachgelagerte Analyse von Blutbestandteilen, die sich aus diesem Protokoll ergeben, kann pharmakokinetische und pharmakodynamische Beziehungen, die Planung der Arzneimitteldosis und den Nachweis des Zielengagements beeinflussen und Einblicke in die Wirkmechanismen von Arzneimitteln geben, die sowohl Echtzeit- als auch introspektive Analysen unterstützen. Wir verwenden dieses Protokoll für onkologische Studien, insbesondere zur Analyse von DNA-Schadensreaktionsmechanismen.
Die durch dieses Protokoll gesammelten Materialien können jedoch für viele Krankheitsbereiche und mehrere therapeutische Modalitäten relevant sein. Nachdem Sie acht Milliliter Spenderblut pro Probe erhalten haben, notieren Sie den Zeitpunkt, zu dem das Blut entnommen wurde, und kehren Sie jedes Röhrchen acht bis 10 Mal vorsichtig um, bevor Sie die mit Gerinnungsmitteln behandelten Blutproben in jedes der für die Strahlung markierten Röhrchen übertragen. Für klinische Proben zentrifugieren Sie die Röhrchen direkt nach der Invertierung.
Legen Sie die 0,2 grauen Röhrchen in einen vorgewärmten Röntgenschrank, schließen Sie die Tür und tragen Sie eine Graudosis von 0,2 auf die Röhrchen auf. Ersetzen Sie die niedrig dosierten bestrahlten Röhrchen durch die sieben grauen Röhrchen und passen Sie die Dosis so an, dass eine dosisbehaftete Strahlendosis von sieben grauen Strahlen auf die hochdosierten Bestrahlungsproben angewendet wird. Nachdem beide Proben bestrahlt wurden, inkubieren Sie alle drei Röhrchen bei 37 Grad Celsius für eine Stunde.
Übertragen Sie die Proben in Zellvorbereitungsröhrchen, bevor Sie die Zellen mit Hochgeschwindigkeitszentrifugation trennen, und stellen Sie sicher, dass die Einheiten auf x g oder gleichwertige RCF eingestellt sind. Betrachten Sie nach der Zentrifugation die Röhrchen vor einem dunklen Hintergrund, um das Plasma, die roten Blutkörperchen und die Buffy-Coat-Schichten zu identifizieren. Mit einer serologischen Pipette etwa die Hälfte des Plasmas in eine markierte 15 Milliliter konische Zentrifuge geben, ohne die Buffy-Coat-Schicht zu stören, und das Plasmarohr auf nassem Eis lagern.
Verwenden Sie dann eine Weidepipette, um die gesamte PBMC-enthaltende Buffy-Schicht in ein neues 15-Milliliter-Röhrchen zu übertragen und PBS bei Raumtemperatur zum PBMC zu einem Endvolumen von 15 Millilitern pro Probe hinzuzufügen. Mischen Sie die Zellen vorsichtig durch Inversion fünfmal und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation mit einer niedrigeren Geschwindigkeit, wobei Sie darauf achten, die Zentrifugationseinheiten zu überprüfen. Saugen Sie alle bis auf die letzten 500 Mikroliter über dem Stand an, ohne die Pellets zu stören.
Fügen Sie frisches PBS zu einem Endvolumen von 10 Millilitern in jedes Rohr hinzu und resuspendieren Sie es, indem Sie die Röhrchen vorsichtig umkehren. Verwenden Sie 40 Mikroliter Aliquoten der Zellen zum Zählen. Sammeln Sie nach dem Zählen die Zellen mit einer weiteren Zentrifugation und entfernen Sie so viel Überstand wie möglich, ohne die Pellets zu stören.
Um das PBMC für die spätere Verarbeitung zu lagern, werden die Pellets in 50 Mikroliter frischem PBS pro Probe mit schonendem Pipettieren resuspendiert und jede gesamte Zellsuspension in ein markiertes 1,5 Milliliter Kryovial auf nassem Eis überführen. Dann frieren Sie die Zellen mit der bevorzugten Methode blitz ein und legen sie bei minus 80 Grad in eine Gefrierbox. Notieren Sie den Zeitpunkt, zu dem die Zellen eingefroren wurden.
Alternativ können die Pellets in einem Milliliter oder Gefriergemisch pro Probe wieder aufgewendet und die Zellsuspensionen auf einzelne markierte Kryoviale übertragen werden. Dann die Röhrchen und vorgekühlten Gefrierboxen für minus 80 Grad Celsius Lagerung aufstellen. Um das Plasma einzufrieren, addieren Sie bis zu einem Milliliter Aliquots Menge des Plasmas zu jeweils bis zu fünf Zweiliter-Mikroröhrchen, ohne das Restpellet zu stören, und zeichnen Sie das Gesamtvolumen des Plasmas in jeder Röhre auf.
Anschließend die Plasmaaliquots sofort aufrecht in einem Gefrierschrank von minus 80 Grad Celsius einfrieren. Für die Western-Blot-Analyse der Proben wird das Pellet in jedem Röhrchen mit einem geeigneten Volumen an Lysepuffer, ergänzt mit Protease- und Phosphataseinhibitoren, die dem des Zellpelletvolumens entsprechen, mit sanftem Pipettieren wieder aufgewendet und die Zellproben 10 Minuten lang auf Eis inkubiert. Am Ende der Inkubation die Proben auf 1,5 Milliliter Röhrchen geben und mit drei 30 Sekunden auf 30 Sekunden Ausschaltzyklen bei vier Grad Celsius beschallen.
Sammeln Sie die Proben durch Zentrifugation und übertragen Sie die Überstände in neue 1,5-Milliliter-Röhrchen. Dann mischen Sie 40 Mikrogramm pro Probe mit Ladepuffer und kochen Sie die Proben für fünf Minuten. Laden Sie 20 Mikrogramm jeder Probe pro Spur in dupliziert in ein 4-12% Bis-Tris Proteingel und führen Sie eine SDS-PAGE aus.
Die Anzahl der Zellen, die aus acht Millilitern Blut gewonnen werden, variiert je nach Patient und Krankheitseinstellung. Im Allgemeinen ist das Zellpellet klein und transparent weiß gefärbt. Manchmal können die Pellets eine Verunreinigung der roten Blutkörperchen aufweisen, was sich negativ auf die Qualität der Zubereitung auswirkt.
Die typische Ausbeute eines Patienten mit chronischer lymphatischer Leukämie, der dieses Protokoll verwendet, variiert zwischen 1,62 mal 10 und dem vierten bis 1,99 mal 10 bis zu den neunten Zellen pro acht Milliliter mononukleäre Zellpräparat mit einer endgültigen Proteinkonzentration zwischen 1,62 und 19,77 Milligramm pro Milliliter. In dieser repräsentativen Analyse von drei Patientenproben wurde eine Zunahme post translationaler Modifikationen bei höheren ionisierenden Strahlendosen beobachtet. Interessanterweise war die Phosphorylierung von Ataxie-Teleangiektasie mutiert und RAD50 war bei der niedrigen Dosis von 0,2 Graustufen erheblich, was darauf hindeutet, dass diese post-translationalen Modifikationen als pharmakodynamische Biomarker für Behandlungen mit der Erzeugung von DNA-Doppelstrangbrüchen mit einem guten Dynamikbereich im Tumor sowie peripheren Blutproben untersucht werden können.
Für eine optimale Probenvorbereitung verarbeiten Sie das Blut innerhalb einer Stunde nach der Entnahme bei Raumtemperatur, zentrifugieren Sie die Proben richtig und betrachten Sie das Röhrchen vor dem dunklen Hintergrund, um die Buffy-Schicht unterscheiden zu können.
