Образцы PBMC и плазмы просты в приобретении и очень информативны на ранних клинических разработках. Этот надежный протокол сводит к минимуму преаналитическую изменчивость, вводимую в клинических центрах. Этот протокол является быстрым и простым, требующим базового лабораторного оборудования и минимального опыта оператора для обработки крови в МПК и плазму.
Это совместимо с напряженными лабораторными днями в больницах. Последующий анализ компонентов крови, полученный в результате этого протокола, может информировать фармакокинетические и фармакодинамические отношения, планирование дозы препарата и доказательство целевого взаимодействия и давать представление о механизмах действия лекарств, поддерживая как анализ в режиме реального времени, так и интроспективный анализ. Мы используем этот протокол для онкологических исследований, в частности, для анализа механизмов реакции на повреждение ДНК.
Тем не менее, материалы, собранные с помощью этого протокола, могут быть актуальны для многих областей заболевания и нескольких терапевтических методов. После получения восьми миллилитров донорской крови на образец запишите время, в течение которого кровь была взята, и осторожно инвертируйте каждую трубку от восьми до 10 раз, прежде чем перенести обработанные антикоагулянтом образцы крови в каждую из пробирок, помеченных для излучения. Для клинических образцов центрифугируют трубки сразу после их инвертирования.
Поместите 0,2 серых трубки в предварительно нагретый рентгеновский шкаф, закройте дверцу и нанесите на трубки дозу 0,2 серого цвета. Замените облученные трубки с низкой дозой семью серыми трубками и скорректируйте дозу, чтобы применить дозу семи серых лучей к образцам облучения с высокой дозой. После того, как оба образца были облучены, инкубируют все три трубки при 37 градусах Цельсия в течение одного часа.
Перенесите образцы в пробирки для подготовки клеток перед разделением ячеек высокоскоростным центрифугированием, убедившись, что единицы установлены как x g или эквивалентный RCF. После центрифугирования просмотрите трубки на темном фоне, чтобы определить слои плазмы, эритроцитов и шерсти. Используя серологическую пипетку, перенесите примерно половину плазмы в меченую 15-миллилитровую коническую центрифугу, не нарушая слой пышного покрытия, и храните трубку плазмы на влажном льду.
Затем используйте пастбищную пипетку, чтобы перенести весь PBMC, содержащий слой пышного покрытия, в новую 15-миллилитровую трубку и добавить PBS комнатной температуры к PBMC до конечного объема 15 миллилитров на образец. Осторожно перемешайте ячейки путем инверсии пять раз и соберите ячейки путем центрифугирования на более низкой скорости, обязательно проверив блоки центрифугирования. Аспирировать все, кроме последних 500 микролитров супернатанта, не нарушая гранул.
Добавьте свежий PBS к конечному объему 10 миллилитров в каждую трубку и повторно суспендируйте, осторожно перевернутые трубки. Используйте 40 микролитровых аликвот клеток для подсчета. После подсчета соберите клетки с помощью другого центрифугирования и удалите как можно больше супернатанта, не нарушая гранулы.
Для хранения PBMC для последующей обработки повторно суспендируют гранулы в 50 микролитрах свежего PBS на образец с мягким пипетированием и переложите каждую целую клеточную суспензию в меченый криовиал 1,5 миллилитра на влажном льду. Затем вспышкой заморозьте ячейки предпочтительным способом и поместите их в морозильную коробку при минус 80 градусах. Запишите время, в которое клетки были заморожены.
Альтернативно, повторно суспендируют гранулы в одном миллилитрах или морозильной смеси на образец и переносят клеточные суспензии на отдельные меченые криовиалы. Затем помещают трубки и предварительно охлажденные морозильные ящики для хранения при минус 80 градусах Цельсия. Чтобы заморозить плазму, добавьте до одного миллилитра аликвоты большого количества плазмы в каждую из пяти двух миллилитровых микротрубок, не нарушая остаточную гранулу, и запишите общий объем плазмы в каждой трубке.
Затем немедленно заморозьте аликвоты плазмы в вертикальной ориентации в морозильной камере при минус 80 градусах Цельсия. Для западного блот-анализа образцов повторно суспендируют гранулу в каждой пробирке с соответствующим объемом буфера лизиса, дополненного ингибиторами протеазы и фосфатазы, равными объему клеточной гранулы с мягким пипетированием, и инкубируют образцы клеток в течение 10 минут на льду. В конце инкубации перенесите образцы в 1,5-миллилитровые трубки и обложите их ультразвуком тремя 30 секундами по 30 секунд вне циклов при четырех градусах Цельсия.
Соберите образцы путем центрифугирования и перенесите супернатанты в новые 1,5-миллилитровые трубки. Затем смешайте 40 микрограммов на образец с буфером загрузки и кипятите образцы в течение пяти минут. Загрузите 20 микрограммов каждого образца на полосу в двух экземплярах в 4-12% белковом геле Bis-Tris и запустите SDS-PAGE.
Количество клеток, полученных из восьми миллилитров крови, варьируется в зависимости от пациента и настроек заболевания. В целом, ячейка гранулы небольшого размера и прозрачного белого цвета. Иногда гранулы могут иметь некоторое загрязнение эритроцитами, что негативно сказывается на качестве препарата.
Типичный выход у пациента с хроническим лимфоцитарным лейкозом, использующего этот протокол, варьируется от 1,62 раза 10 до четвертого до 1,99 раза 10-девятой клетки на восемь миллилитров мононуклеарного клеточного препарата с конечной концентрацией белка в диапазоне от 1,62 до 19,77 миллиграмма на миллилитр. В этом репрезентативном анализе образцов трех пациентов наблюдалось увеличение постпереводных модификаций при более высоких дозах ионизирующего излучения. Интересно, что фосфорилирование атаксии-телеангиэктазии мутировало и RAD50 было существенным при низкой дозе 0,2 грея, что говорит о том, что эти постпереклянтные модификации могут быть реально изучены как фармакодинамические биомаркеры для лечения, включающего генерацию двухцепочечных разрывов ДНК с хорошим динамическим диапазоном в опухоли, а также образцов периферической крови.
Для оптимальной пробоподготовки обработайте кровь в течение одного часа после сбора при комнатной температуре, правильно центрифугировать образцы и просмотреть трубку на темном фоне, чтобы иметь возможность различить пышную шерсть.
