PBMC ודגימות פלזמה הם פשוט לרכוש ואינפורמטיבי מאוד בפיתוח קליני מוקדם. פרוטוקול חזק זה ממזער את השונות הטרום-אנליטית שהוצגה באתרים קליניים. פרוטוקול זה הוא מהיר וקל, הדורש ציוד מעבדה בסיסי ומומחיות מפעיל מינימלית כדי לעבד את הדם לתוך PBMCs ופלזמה.
זה תואם לימי מעבדה עמוסים בבתי חולים. ניתוח במורד הזרם של רכיבי דם הנובעים מפרוטוקול זה יכול ליידע יחסים פרמקוקינטיים ופרמקודינמיים, תזמון מינון תרופות והוכחת מעורבות היעד ולספק תובנות על מנגנוני פעולה של תרופות, התומכים הן בניתוח בזמן אמת והן בניתוח אינטרוספקטיבי. אנו משתמשים בפרוטוקול זה למחקרים אונקולוגיים, במיוחד כדי לנתח מנגנוני תגובה נזק DNA.
עם זאת, חומרים שנאספו על ידי פרוטוקול זה יכולים להיות רלוונטיים על פני תחומי מחלה רבים ואפנים טיפוליות מרובות. לאחר קבלת שמונה מיליליטר של דם תורם לכל דגימה, להקליט את הזמן שבו הדם נמשך בעדינות להפוך כל צינור שמונה עד 10 פעמים לפני העברת דגימות דם מטופלים נוגדי קרישה לתוך כל אחד הצינורות שכותרתו קרינה. לדגימות קליניות, צנטריפוגה הצינורות מיד לאחר היפוך אותם.
מניחים את 0.2 צינורות אפורים בארון רנטגן מחומם מראש, לסגור את הדלת ולהחיל מנה אפורה 0.2 על הצינורות. החלף את הצינורות המוקרנים במינון נמוך בשבעת הצינורות האפורים והתאם את המינון כדי להחיל מינון קרינה אפורה שבעה לדגימות הקרינה במינון גבוה. לאחר ששתי הדגימות הוקרנו, דגירו את כל שלושת הצינורות ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה.
העבר את הדגימות לצינורות הכנת תאים לפני הפרדת התאים עם צנטריפוגה במהירות גבוהה, הקפד להגדיר את היחידות כמו x g או שווה ערך RCF. לאחר הצנטריפוגה, להציג את הצינורות על רקע כהה כדי לזהות את הפלזמה, תא הדם האדום, ושכבות מעיל באפי. באמצעות פיפטה סרולוגית, להעביר כמחצית הפלזמה לתוך צנטריפוגה חרוט 15 מיליליטר שכותרתו מבלי להפריע שכבת מעיל באפי ולאחסן את הצינור של פלזמה על קרח רטוב.
לאחר מכן, השתמש פיפטה מרעה להעביר את כל PBMC המכיל שכבת מעיל באפי לתוך צינור חדש 15 מיליליטר ולהוסיף PBS טמפרטורת החדר PBMC לנפח הסופי של 15 מיליליטר לכל מדגם. מערבבים בעדינות את התאים על ידי היפוך חמש פעמים ולאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה יותר, הקפד לבדוק את יחידות צנטריפוגה. לשאוף את כל אבל האחרון 500 microliters של supernatant מבלי להפריע כדורי.
מוסיפים PBS טרי לנפח סופי של 10 מיליליטר לכל צינור ומחדשים על ידי היפוך עדין של הצינורות. השתמש 40 aliquots microliter של התאים לספירה. לאחר הספירה, לאסוף את התאים עם צנטריפוגה אחרת ולהסיר כמה שיותר supernatant ככל האפשר מבלי להפריע כדורי.
כדי לאחסן את PBMC לעיבוד מאוחר יותר, resuspend כדורי ב 50 microliters של PBS טריים לכל מדגם עם צינור עדין ולהעביר כל השעיית תא שלם לתוך cryovial 1.5 מיליליטר שכותרתו על קרח רטוב. ואז פלאש להקפיא את התאים בשיטה המועדפת ומניחים אותם בתיבת הקפאה במינוס 80 מעלות. רשום את השעה שבה התאים הוקפאו.
לחלופין, resuspend כדורי תערובת אחת מיליליטר או הקפאה לכל מדגם ולהעביר את המתלים התא בודדים שכותרתו cryovials. לאחר מכן הניחו את הצינורות ואת תיבות ההקפאה המצונן מראש עבור מינוס 80 מעלות צלזיוס אחסון. כדי להקפיא את הפלזמה, להוסיף עד aliquots מיליליטר אחד הרבה פלזמה עד כל אחד מחמשת microtubes שני מיליליטר מבלי להפריע גלולה שיורית ולתעד את הנפח הכולל של פלזמה בכל צינור.
לאחר מכן, להקפיא מיד את aliquots פלזמה בכיוון זקוף במקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס. לניתוח כתם מערבי של הדגימות, resuspend גלולה בכל צינור עם נפח מתאים של מאגר תמוגה בתוספת מעכבי פרוטאז ופוספטאז שווה לזה של נפח גלולת התא עם צינור עדין דגירה דגימות התא במשך 10 דקות על הקרח. בסוף הדגירה, להעביר את הדגימות לצינורות 1.5 מיליליטר sonicate אותם עם שלוש 30 שניות על 30 שניות את מחזורי ב 4 מעלות צלזיוס.
לאסוף את הדגימות על ידי צנטריפוגה ולהעביר את supernatants לצינורות 1.5 מיליליטר חדשים. לאחר מכן, מערבבים 40 מיקרוגרם לדגימה עם מאגר טעינה ומרתיחים את הדגימות במשך חמש דקות. טען 20 מיקרוגרם של כל דגימה לנתיב בכפילות בג'ל חלבון ביס-טריס של 4-12% והפעל SDS-PAGE.
מספר התאים המתקבלים משמונה מיליליטר של דם משתנה בהתאם למטופל ולהגדרת המחלה. באופן כללי, גלולת התא הוא קטן בגודל לבן שקוף בצבע. לפעמים כדורי יכול להיות קצת זיהום תאי דם אדומים, אשר יש השפעה שלילית על איכות ההכנה.
תשואה אופיינית מחולה לוקמיה לימפוציטית כרונית באמצעות פרוטוקול זה משתנה בין 1.62 פעמים 10 לרביעי עד 1.99 פעמים 10 לתאים התשיעיים לכל שמונה מיליליטר מונונוקלר הכנת תא עם ריכוז חלבון סופי הנע בין 1.62 ל 19.77 מיליגרם למיליליטר. בניתוח מייצג זה של שלוש דגימות חולים, נצפתה עלייה בשינויים שלאחר התרגום במינוני קרינה מייננת גבוהים יותר. מעניין, הזרחן של אטקסיה-telangiectasia מוטציה RAD50 היה משמעותי במינון הנמוך של 0.2 אפורים, אשר מציע אלה שינויים שלאחר תרגום עשוי להיחקר באופן ריאלי כמו סמנים ביולוגיים פרמקודינמיים לטיפולים מעורבים הדור של DNA כפול גדיל שובר עם טווח דינמי טוב בגידול, כמו גם דגימות דם היקפיות.
להכנת מדגם אופטימלי, לעבד את הדם בתוך שעה אחת של איסוף בטמפרטורת החדר, צנטריפוגה הדגימות כראוי, ולהציג את הצינור על רקע כהה כדי להיות מסוגל להבחין בין מעיל באפי.
