PBMCおよび血漿サンプルは、早期臨床開発において入手が容易で、非常に有益です。この強い議定書は臨床現場で導入される前分析の変動を最小にする。このプロトコルは速く、容易で、PBMCおよび血漿に血液を処理するために基本的な実験室装置および最低のオペレータの専門知識を要求する。
病院での忙しい研究室の日と互換性があります。このプロトコルから生じる血液成分の下流分析は、薬物動態および薬物力学関係、薬物用量スケジューリングおよび標的関与の証明を知らせ、リアルタイムおよび内省的分析の両方をサポートする薬物作用機序に関する洞察を提供することができる。このプロトコルは、特にDNA損傷応答機構を分析するために、腫瘍学の研究に使用します。
しかし、このプロトコルによって収集された材料は、多くの疾患領域および複数の治療様式に関連する可能性がある。サンプルあたり8ミリリットルのドナー血液を受け取った後、血液が採取された時間を記録し、各チューブを8〜10回穏やかに反転してから、抗凝固剤処理血液サンプルを放射線用に標識された各チューブに移す。臨床サンプルの場合、チューブを反転した直後に遠心分離します。
0.2グレーのチューブを事前に温めたX線キャビネットに入れ、ドアを閉め、チューブに0.2グレーの線量を適用します。低線量照射チューブを7つのグレーチューブに交換し、高線量照射サンプルに7つの灰色の放射線量を適用するように線量を調整します。両方のサンプルを照射した後、37°Cで3つのチューブすべてを1時間インキュベートします。
高速遠心分離で細胞を分離する前にサンプルを細胞調製チューブに移し、単位をx gまたは同等のRCFとして設定してください。遠心分離後、暗い背景にチューブを見て、血漿、赤血球、およびバフィーコート層を識別します。血清学的ピペットを使用して、バフィーコート層を乱すことなく、プラズマの約半分をラベル付きの15ミリリットル円錐形遠心分離機に移し、プラズマのチューブを湿った氷の上に保管します。
次に、牧草地のピペットを使用して、バフィーコート層を含むPBMC全体を新しい15ミリリットルチューブに移し、室温PBSをPBMCに加えて、サンプルあたり15ミリリットルの最終体積にします。細胞を反転によって5回軽く混合し、遠心分離により細胞を収集し、遠心分離ユニットを確認してください。ペレットを乱すことなく、上清の最後の500マイクロリットルを除くすべてを吸引します。
各チューブに10ミリリットルの最終体積に新鮮なPBSを加え、チューブをそっと反転して再中断します。カウント用に細胞の40マイクロリットルアリコートを使用してください。カウント後、別の遠心分離で細胞を収集し、ペレットを乱すことなく、できるだけ多くの上清を除去します。
後で処理するためにPBMCを保存するには、ペレットを穏やかなピペットでサンプルあたり50マイクロリットルの新鮮なPBSで再懸濁し、各細胞懸濁液全体を湿った氷の上でラベル付けされた1.5ミリリットルのクライオビアルに移します。その後、フラッシュは、好ましい方法で細胞を凍結し、マイナス80度で凍結ボックスに配置します。セルが凍結された時刻を記録します。
あるいは、サンプルごとに1ミリリットルまたは凍結混合物中のペレットを再懸濁し、細胞懸濁液を個々の標識された凍結に移す。その後、マイナス80度の貯蔵のためのチューブと事前に冷やされた冷凍ボックスを置きました。プラズマを凍結するには、残りのペレットを乱すことなく、最大5つの2ミリリットルマイクロチューブのそれぞれにプラズマの1ミリリットルのアリコートロットを追加し、各チューブ内のプラズマの総量を記録します。
次に、プラズマアリコートを直立方向にマイナス80°Cの冷凍庫で直ちに凍結します。サンプルのウェスタンブロット分析の場合、各チューブ内のペレットを、穏やかなピペットで細胞ペレットの容量と同等のタンパク質およびホスファターゼ阻害剤を添加した適切な量のリシスバッファーで再懸濁し、氷上で10分間細胞サンプルをインキュベートします。インキュベーションの最後に、サンプルを1.5ミリリットルのチューブに移し、摂氏4度で30秒オフサイクルで30秒で30秒で超音波処理します。
遠心分離によってサンプルを収集し、新しい1.5ミリリットルチューブに上清を転送します。次に、サンプルあたり40マイクログラムをローディングバッファと混ぜ、サンプルを5分間沸騰させます。4-12%Bis-Trisタンパク質ゲルに各レーンの各サンプルの20マイクログラムを重複してロードし、SDS-PAGEを実行します。
血液の8ミリリットルから得られる細胞の数は、患者と病気の設定によって異なります。一般に、細胞ペレットはサイズが小さく、透明な白色である。時にはペレットは、いくつかの赤血球汚染を有することができ、これは調製物の品質に悪影響を及ぼす。
このプロトコルを使用する慢性リンパ性白血病患者からの典型的な収量は、1ミリリットル当たり1.62〜19.77ミリグラムの範囲の最終的なタンパク質濃度を有する8ミリリットル単核細胞調製あたり1.62倍から4番目から1.99倍の10〜1.99倍の10〜1.99倍の範囲で変化する。3人の患者サンプルの本代表分析では、より高い電離放射線量で翻訳後修飾の増加が観察された。興味深いことに、運動失調-毛帯拡張症のリン酸化は0.2グレイの低用量で相当であったため、これらの翻訳後修飾は、腫瘍の良好な動的範囲を有するDNA二重鎖の生成を伴う治療のための薬物力学的バイオマーカーとして現実的に尋問される可能性があることを示唆している。
最適なサンプル調製のために、採取から1時間以内に血液を室温で処理し、サンプルを正しく遠心分離し、チューブを暗い背景に対して見て、バフィーコートを区別することができます。
