El ARN modificado es un método novedoso para la transferencia de genes al corazón y a otros órganos. Este protocolo proporcionará un enfoque preciso de la entrega de genes deseados transitoriamente al corazón, después del infarto de miocardio. Este método no se limita al infarto de miocardio, sino que también se puede aplicar a la reperfusión de isquemia y a los modelos de constricción aórtica transversal.
El ARN modificado se utiliza en varios ensayos clínicos en humanos. Sin embargo, no existe un protocolo estandarizado para el gen transferido al corazón utilizando este método. La demostración visual permitirá a los investigadores inyectar correctamente ARN modificado en los sitios apropiados del corazón.
Demostrando el procedule estarán Ajit Magadum, un tipo postdoctoral, y Elena Chepurko, supervisora animal de nuestro laboratorio. Sobre la base de la concentración de la previamente preparada en modRNA, calcular el volumen de modRNA necesario para una inyección de 100 microgramos. Hace volúmenes iguales de soluciones de sacarosa y citrato.
A continuación, agregue el volumen calculado de modRNA, y suficiente solución salina para llevar el volumen de inyección a 60 microlitros. Después de anestesiar al animal, colóquelo hacia arriba, con la boca hacia el experimentador. A continuación, para mantener una vía aérea abierta mediante la realización de intubación intratraqueal, tire suavemente de la lengua.
Ajuste el ángulo del cuello para enderezar la trayectoria de intubación y empuje la cánula de intubación. Observe el movimiento torácico del ratón para verificar que ambos pulmones están recibiendo oxígeno. La frecuencia respiratoria debe ser de aproximadamente 120 respiraciones por minuto.
Para comenzar la ligadura LAD, gire el ratón cuidadosamente sobre su lado derecho. levantar la piel, y realizar una toracotomía del lado izquierdo entre la tercera y la cuarta costillas. Abra el tórax con cuidado, sin tocar los pulmones con objetos afilados.
Coloque los retractores en la incisión para mantener la cavidad torácica abierta, proporcionando una visión clara del corazón. A continuación, mueva los pulmones al borde de la incisión y retire la parte del saco pericárdico que está cubriendo el corazón. Identifique cuidadosamente el LAD, un vaso rojo claro, situado entre la arteria pulmonar y la aurícula izquierda.
Ligar el LAD proximal con una sola sutura de seda. Con una jeringa de insulina, administre al corazón un total de 60 microlitros de la solución modRNA. Inyectar 20 microlitros por vía intramuscular, en tres sitios diferentes.
Un sitio a cada lado de la ligadura y otro en el ápice del corazón. La mejor manera de inyectar el ARN modificado en los sitios correctos, es observar la decoloración del tejido bajo el microscopio, después de la oclusión de LAD. También cuando se inyecta, no vaya demasiado profundo en el tejido para llegar a las cavidades del corazón en la circulación.
Cierre la incisión torácica en capas. El primer uso fue 6-0 suturas de running de seda para adaptar las costillas. A continuación, utilice suturas de running de seda 5-0 para cerrar la piel.
Para la fase de recuperación, retire la cánula y permita la respiración espontánea. Coloque el animal en una almohadilla calefactora hasta que recupere la conciencia. No deje al animal desatendido hasta que esté completamente despierto.
Para controlar el dolor postquirúrgico, inyecte buprenorfina por vía subcutánea a intervalos de 12 horas durante tres días. A una dosis de 0,1 miligramos por kilogramo de peso corporal. 24 horas después de la ligadura de LAD y la inyección de modRNA luciferasa en ratones CFW, la transfección se validó comprobando la expresión de la proteína luciferasa utilizando un sistema de imágenes de bioluminiscencia.
La señal de luciferasa se puede detectar claramente en imágenes que comparan ratones de control, con ratones inyectados con modRNA luciferasa. La cuantificación de la señal de luciferasa muestra una expresión proteica significativamente mayor en ratones tratados que en ratones de control. La expresión de cre modRNA fue validada comprobando su traducción y biodispresión en ratones transgénicos ROSA26 mTmG.
24 horas después de la cirugía y la inyección de cre modRNA, las artes se fijaron y procesaron para la inmunomancha con marcador de cardiomiocitos, troponina cardíaca I y marcador de núcleos DAPI. La expresión exitosa de la cre era evidente debido a la aparición de cardiomiocitos de color verde. Una imagen combinada muestra celdas activadas cre alrededor de los dos sitios de inyección visibles.
El azul es la mancha nuclear DAPI. La plataforma de ARN modificada puede proporcionar un solo gen o combinaciones genéticas en una variedad de órganos. Y por lo tanto se puede utilizar con fines terapéuticos, tales como corregir trastornos genéticos, o la activación de mecanismos beneficiosos en el cuerpo.
La farmacocinética única del ARN modificado nos permite evaluar la función génica inmediatamente después de su inyección. Esto permite al investigador apuntar a las vías de señalización, que se alteran en las primeras horas de infarto.
