Modified RNA ist eine neuartige Methode für den Gentransfer zum Herzen und anderen Organen. Dieses Protokoll wird einen genauen Ansatz bieten, um gewünschte Gene vorübergehend an das Herz zu liefern, nach dem Myokardinfarkt. Diese Methode ist nicht auf Myokardinfarkt beschränkt, sondern kann auch auf Ischämie-Reperfusion und transversale Aortenverengungsmodelle angewendet werden.
Modifizierte RNA wird in mehreren klinischen Studien am Menschen verwendet. Es gibt jedoch kein standardisiertes Protokoll für Gen, das mit dieser Methode ins Herz übertragen wird. Die visuelle Demonstration wird es Forschern ermöglichen, modifizierte RNA an geeigneten Stellen im Herzen korrekt zu injizieren.
Die Vorführung des Procedule wird Ajit Magadum, ein Postdoktorand, und Elena Chepurko eine Tierbetreuerin aus unserem Labor sein. Berechnen Sie auf Basis der Konzentration der zuvor bei modRNA vorbereiteten ModRNA das Volumen von modRNA, das für eine 100-Mikrogramm-Injektion benötigt wird. Macht gleiche Volumina von Saccharose- und Citratlösungen.
Fügen Sie dann das berechnete Volumen von modRNA und genügend Saline-Lösung hinzu, um das Injektionsvolumen auf 60 Mikroliter zu bringen. Nach der Anästhesisierung des Tieres, legen Sie es ventrale Seite nach oben, mit dem Mund in Richtung des Experimentators. Dann, um eine offene Atemwege durch intratrachealen Intubation zu halten, ziehen Sie vorsichtig die Zunge heraus.
Stellen Sie den Winkel des Halses ein, um den Intubationspfad zu begradigen, und drücken Sie die Intubationskanüle ein. Beobachten Sie die Brustbewegung der Maus, um zu überprüfen, ob beide Lungen Sauerstoff erhalten. Die Atemfrequenz sollte etwa 120 Atemzüge pro Minute betragen.
Um die LAD-Ligation zu beginnen, drehen Sie die Maus vorsichtig auf die rechte Seite. heben Sie die Haut, und führen Sie eine linke Thorakotomie zwischen der dritten und vierten Rippe. Öffnen Sie den Thorax vorsichtig, ohne die Lunge mit scharfen Gegenständen zu berühren.
Legen Sie Retraktoren in den Schnitt, um die Brusthöhle offen zu halten, was einen klaren Blick auf das Herz bietet. Als nächstes bewegen Sie die Lunge an den Rand des Einschnitts, und entfernen Sie den Teil des Perikardsacks, der das Herz bedeckt. Identifizieren Sie sorgfältig das LAD, ein tiefhelles rotes Gefäß, das sich zwischen der Lungenarterie und der linken Ohrmuschel befindet.
Ligate die proximale LAD mit einer einzigen Seidennaht. Mit einer Insulinspritze insgesamt 60 Mikroliter der modRNA-Lösung an das Herz liefern. Injizieren Sie 20 Mikroliter intramuskulär an drei verschiedenen Stellen.
Eine Seite auf jeder Seite der Ligation und eine in der Spitze des Herzens. Der beste Weg, die modifizierte RNA an den richtigen Stellen zu injizieren, ist die Verfärbung des Gewebes unter dem Mikroskop zu beobachten, nach der Okklusion von LAD. Auch bei Injektion nicht zu tief in das Gewebe gehen, um die Herzkammern in den Kreislauf zu erreichen.
Schließen Sie den Thoraxschnitt in Schichten. Der erste Einsatz war 6-0 Seidenlauf Nähte, um die Rippen anzupassen. Verwenden Sie dann 5-0 SeidenlaufNähte, um die Haut zu schließen.
Für die Erholungsphase, entfernen Sie die Kanüle, und ermöglichen spontane Atmung. Legen Sie das Tier auf ein Heizkissen, bis es das Bewusstsein wiedererlangt. Lassen Sie das Tier nicht unbeaufsichtigt, bis es vollständig wach ist.
Um postchirurgische Schmerzen zu bewältigen, injizieren Sie Buprenorphin subkutan in 12-Stunden-Intervallen für drei Tage. Bei einer Dosis von 0,1 Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht. 24 Stunden nach der LAD-Ligation und Injektion von Luziferase modRNA bei CFW-Mäusen wurde die Transfektion durch Überprüfung auf Luciferase-Proteinexpression mit einem Biolumineszenz-Bildgebungssystem validiert.
Das Luziferase-Signal kann deutlich in Bildern nachgewiesen werden, die Kontrollmäuse mit Mäusen vergleichen, die mit Luziferase-ModRNA injiziert werden. Die Quantifizierung des Luziferase-Signals zeigt eine signifikant höhere Proteinexpression bei behandelten Mäusen als bei Kontrollmäusen. Die Cre modRNA-Expression wurde durch die Überprüfung ihrer Übersetzung und Bioverteilung bei transgenen ROSA26 mTmG-Mäusen validiert.
24 Stunden nach der Operation und der Cre-ModRNA-Injektion wurden Die Künste für die Immunfärbung mit Kardiomyozytenmarker, Herztroponin I und Kernmarker DAPI fixiert und verarbeitet. Erfolgreiche Cre-Expression war durch das Auftreten von grün gefärbten Kardiomyozyten offensichtlich. Ein zusammengeführtes Bild zeigt krementierte Zellen um die beiden sichtbaren Injektionsstellen.
Blau ist der nukleare Fleck DAPI. Modifizierte RNA-Plattform kann ein einzelnes Gen oder Gen Kombinationen in verschiedenen Organen liefern. Und kann so für therapeutische Zwecke verwendet werden, wie die Korrektur genetischer Störungen, oder aktivierung stuernden Mechanismen im Körper.
Die einzigartige Pharmakokinetik modifizierter RNA ermöglicht es uns, die Genfunktion unmittelbar nach der Injektion zu bewerten. Dies ermöglicht es Forschern, Signalwege zu zielen, die in den ersten Stunden des Infarkts verändert werden.
