변형된 RNA는 심장, 및 기타 장기로 유전자 전달을 위한 새로운 방법입니다. 이 프로토콜은 심장에 일시적으로 원하는 유전자를 전달하는 정확한 접근 방식을 제공 할 것입니다, 심근 경색을 게시. 이 방법은 심근 경색에 국한되지 않고 허혈 재관류 및 횡방향 대동맥 수축 모델에도 적용될 수 있습니다.
변형 된 RNA는 여러 인간 임상 시험에서 사용되고 있습니다. 그러나, 이 방법을 사용하여 심장으로 옮겨진 유전자를 위한 표준화된 프로토콜은 없습니다. 시각적 데모는 연구원이 심장에 있는 적당한 사이트에 수정된 RNA를 정확하게 주입하는 가능하게 할 것입니다.
절차 시연은 박사 후 동료인 아짓 마가둠과 실험실의 동물 감독자 엘레나 체푸르코가 될 것입니다. modRNA에서 이전에 제조된 의 농도에 기초하여, 100 마이크로그램 주입에 필요한 modRNA의 부피를 계산한다. 자당 및 구연산 솔루션의 동일한 볼륨을 만든다.
그런 다음 계산된 양의 modRNA를 추가하고 충분한 식염수 용액을 추가하여 60 마이크로리터에 사출 볼륨을 가져옵니다. 동물을 마취한 후, 입이 실험자쪽으로 향하여 복부를 위로 올려 놓습니다. 그런 다음 내 내 삽 관을 수행하여 개방된 기도를 유지하려면 혀를 부드럽게 당깁니다.
목각도를 조정하여 삽관 경로를 곧게 펴고 삽관 캐뉼라를 밀어 넣습니다. 마우스의 흉부 움직임을 관찰하여 두 폐가 산소를 받고 있는지 확인합니다. 호흡 속도는 분당 약 120 호흡이어야 합니다.
LAD 결찰을 시작하려면 마우스를 오른쪽으로 조심스럽게 돌립니다. 피부를 들어 올리고 세 번째 갈비뼈와 네 번째 갈비뼈 사이에 좌측 흉부 절제술을 수행합니다. 날카로운 물체로 폐를 건드리지 않고 흉부를 조심스럽게 엽니다.
흉부 구멍을 열어 두기 위해 방수에 리트랙터를 배치하여 심장의 선명한 전망을 제공합니다. 다음으로 폐를 절개 가장자리로 이동하고 심장을 덮고 있는 심근 낭의 일부를 제거합니다. 폐 동맥과 왼쪽 오리엔클 사이에 위치한 깊은 빛 빨간 배인 LAD를 주의 깊게 식별합니다.
하나의 실크 봉합사와 근위 LAD를 리게이트. 인슐린 주사기를 사용하여, 심장에 modRNA 용액의 총 60 마이크로 리터를 제공합니다. 3개의 다른 사이트에, 근육질로 20 마이크로리터를 주입하십시오.
결찰의 각 측면에 하나의 사이트와 마음의 정점에 하나. 올바른 부위에 수정된 RNA를 주입하는 가장 좋은 방법은 LAD의 폐색 후 현미경으로 조직의 변색을 관찰하는 것입니다. 또한 주입 할 때, 순환으로 심장 챔버에 도달하기 위해 조직에 너무 깊이 가지 마십시오.
층의 흉부 절개를 닫습니다. 첫 번째 사용은 갈비뼈를 적응시키기 위해 6-0 실크 러닝 봉합사였습니다. 그런 다음 5-0 실크 러닝 봉합사를 사용하여 피부를 닫습니다.
회복 단계의 경우 캐뉼라를 제거하고 자발적인 호흡을 허용하십시오. 동물을 의식을 되찾을 때까지 가열 패드에 놓습니다. 동물이 완전히 깨어날 때까지 방치하지 마십시오.
수술 후 통증을 관리하려면 3 일 동안 12 시간 간격으로 buprenorphine을 피하하십시오. 체중의 킬로그램 당 0.1 밀리 그램의 복용량에서. CFW 마우스에서 LAD 결찰 및 루시파라제 모RNA의 주입 후 24시간 후, 생물 발광 이미징 시스템을 사용하여 루시파아제 단백질 발현을 검사하여 경질을 검증하였다.
루시파라제 신호는 대조군 마우스를 비교하는 이미지에서 루시파아제 모RNA를 주입한 마우스에 명확하게 검출될 수 있다. 루시파라제 신호의 정량화는 대조군 마우스보다 처리된 마우스에서 훨씬 더 높은 단백질 발현을 나타낸다. Cre modRNA 발현은 형질전환 ROSA26 mTmG 마우스에서의 번역 및 바이오 분포를 확인함으로써 검증되었다.
수술 후 24시간 및 cre modRNA 주사 후, 심근세포 마커, 심장 트로포닌 I 및 핵 마커 DAPI를 통해 면역염색을 위해 예술이 고정및 처리되었다. 성공적인 cre 표현은 녹색 색의 심근 세포의 모양으로 인해 분명했다. 병합된 이미지는 두 개의 눈에 보이는 사출 사이트 주위에 cre 활성 셀을 보여 주입니다.
블루는 핵 얼룩 DAPI입니다. 변형된 RNA 플랫폼은 다양한 장기에서 단일 유전자 또는 유전자 조합을 제공할 수 있다. 따라서 유전 적 질환을 교정하거나 신체의 유익한 메커니즘을 활성화하는 것과 같은 치료 목적으로 사용할 수 있습니다.
수정 된 RNA의 독특한 약물 동종은 우리가 주입 직후 유전자 기능을 평가 할 수 있습니다. 이것은 연구원이 경색의 처음 몇 시간에서 변경되는 신호 통로를 표적으로 하는 가능하게 합니다.
